红芪多糖对骨髓间充质干细胞和成骨细胞的影响

赵良功，方瑶瑶，刘小花，封士兰*

红芪多糖对骨髓间充质干细胞和成骨细胞的影响

赵良功1, 2，方瑶瑶3，刘小花3，封士兰3*

1. 甘肃省骨关节疾病研究重点实验室，甘肃 兰州 730000 2. 兰州大学第二医院，甘肃 兰州 730000 3. 兰州大学药学院，甘肃 兰州 730000

研究3种新型红芪多糖（HPS-1、HPS-2、HPS-3）对大鼠骨髓间充质干细胞rBMSCs和颅骨成骨细胞ROBs成骨性分化的影响。采用MTT法检测rBMSCs细胞和ROBs细胞增殖；采用碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）试剂盒检测rBMSCs细胞和ROBs细胞的ALP活性；采用茜素红染法检测rBMSCs和ROBs细胞矿化结节的形成情况。HPS-1（20、50 µg/mL）作用48 h显著促进rBMSCs细胞增殖（＜0.05、0.01），HPS-1（20 µg/mL）作用48 h显著促进ROBs细胞增殖（＜0.01）；HPS-2和HPS-3对2种细胞的增殖无促进作用。HPS-1（50、100 µg/mL）显著升高rBMSCs细胞的ALP活性（＜0.01），HPS-1（10、20、50 µg/mL）显著升高ROBs细胞的ALP活性（＜0.05、0.01）；HPS-3（50 µg/mL）显著升高rBMSCs细胞的ALP活性（＜0.05），HPS-2对2种细胞ALP活性没有促进作用。HPS-1显著增加rBMSCs和ROBs细胞中钙化结节面积和数量（＜0.01），HPS-2和HPS-3对rBMSCs和ROBs细胞钙化结节的形成没有促进作用。HPS-1可增强rBMSCs和ROBs细胞ALP活性和成骨相关因子表达，并显著促进rBMSCs和ROBs细胞分化、矿化。

红芪多糖；成骨分化；骨髓间充质干细胞；颅骨成骨细胞；碱性磷酸酶

红芪是豆科植物多序岩黄芪Hand. -Mazz. 的干燥根，为甘肃省的道地药材。红芪的主要成分包括多糖类、黄酮类、皂苷类、多种氨基酸类等，其中红芪多糖（hedysarum polysaccharides，HPS）是红芪的主要药效成分，具有提高免疫力、抗衰老、抗肝纤维化、抗氧化等药理作用[1]。课题组前期研究发现经传统水提法分离纯化的红芪多糖HPS3d可促进成骨细胞增殖分化，具有防治骨质疏松的潜质[2]。传统的水提法提取率低、溶解度差、后期纯化困难，课题组采用复合酶联合超声提取工艺显著提高了红芪粗多糖的得率和含量[3]；红芪粗多糖采用DEAE-52柱色谱分离纯化，用蒸馏水及0.1、0.3 mol/L氯化钠溶液依次洗脱，得到3种免疫活性较好的均质性多糖组分（HPS-1、HPS-2、HPS-3）[4]。气相色谱分析表明，3种新型多糖均由鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖5种单糖组成，HPS3d不含甘露糖；3种新型多糖蛋白质含量均低于HPS3d；HPS-1多糖含量高于HPS3d且相对分子质量远小于HPS3d[2,4]。本研究探讨3种新型红芪多糖（HPS-1、HPS-2、HPS-3）对大鼠骨髓间充质干细胞rBMSCs和颅骨成骨细胞ROBs增殖、分化和矿化的影响，为红芪多糖的后续研究开发奠定基础。

1 材料

1.1 动物

SPF级SD雄性大鼠，1月龄，体质量120～170 g；SPF级出生48 h以内的SD大鼠乳鼠，体质量25～30 g，均由兰州大学实验动物中心提供，动物许可证号SCXK（甘）2013-0002。动物分笼饲养，3只/笼，在（22±2）℃、12 h光/暗周期、相对湿度（50±5）%下，自由饮食饮水，适应性饲养1周。所有程序和实验规程均经兰州大学动物保护与使用伦理委员会批准，批准号SCXK（GaN）2018-0002，并按照国际标准和动物福利道德准则进行。

1.2 药品与试剂

胎牛血清购自Clark公司；II型胶原酶购自Biosharp公司；青霉素、链霉素、DMEM培养基、DMEM/F12培养基，购自Hyclone公司；0.25%胰蛋白酶、柠檬酸、地塞米松（质量分数为98%）、抗坏血酸、柠檬酸钠、β-甘油磷酸钠均购自索莱宝公司；碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）试剂盒（批号20180614）购自南京建成生物工程研究所；木瓜蛋白酶、纤维素酶，购自上海麦克林生化科技有限公司；95%乙醇、醋酸乙酯均为分析纯。

1.3 仪器

BS224S/BP211D电子分析天平（德国Sartorius公司）；XK96-6调速平板振荡器（姜堰市新康医疗器械有限公司）；KQ-3200DE型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；CKX53倒置相差显微镜（日本Olympus公司）；CO-150型CO2细胞培养箱（美国LabServ公司）；DK-98-Ⅱ型电热恒水浴锅（天津市泰斯特仪器有限公司）；Vaioskan Flash多功能酶标仪（美国赛默飞世尔公司）；移液枪（德国Eppendorf公司）。

2 方法

2.1 红芪多糖的制备

采用复合酶联合超声提取法制备得到红芪粗多糖[3,5]。将红芪粗多糖加适量蒸馏水溶解后，经DEAE-52柱分离纯化，用蒸馏水及0.1、0.3 mol/L氯化钠溶液依次洗脱，得到3个多糖组分，分别为HPS-1、HPS-2、HPS-3，多糖质量分数分别为96.44%、98.02%、95.20%。

2.2 rBMSCs细胞和ROBs细胞的分离培养

2.2.1 贴壁分离法体外培养rBMSCs细胞 SD大鼠脱颈椎处死，75%酒精浸泡消毒10 min，无菌剥离股骨和胫骨，剪去两端骨骺，将DMEM/F12培养基（含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、1000 U/mL链霉素）注入骨髓腔并反复冲洗，收集细胞悬液，过200目细胞筛得到单细胞悬液。调整细胞密度为1×107/mL，接种于25 cm2培养瓶中，于37 ℃、5% CO2培养箱中培养，次日更换培养基，之后每2天用无菌磷酸盐缓冲液洗涤3次，并更换培养基。当细胞融合度达到80%以上时，以0.25%胰蛋白酶消化传代用于后续实验。

2.2.2 酶消解法体外分离培养ROBs细胞 新生SD大鼠乳鼠，75%酒精浸泡消毒10 min，无菌取颅骨，剔除血管和结缔组织，无菌PBS冲洗2次，将颅骨剪碎至约1 mm3。碎骨片装入无菌培养瓶中，加入胰蛋白酶（0.5 mg/mL）于37 ℃振荡消化2次，10 min/次，弃去消化液；加入II型胶原酶（1 mg/mL）于37 ℃振荡消化6次，15 min次。收集最后4次消化液，过200目细胞筛除去骨碎片，将单细胞悬液调整至细胞密度为3×104/mL，接种于25 cm2培养瓶中。于37 ℃、5% CO2培养箱中培养，次日更换培养基，之后每2天用无菌磷酸盐缓冲液洗涤3次。当细胞融合度达到80%以上时，以0.25%胰蛋白酶消化传代用于后续实验[6]。

2.3 药物的配制

分别精密称取HPS-1、HPS-2、HPS-3，溶解于培养基中，分别制成质量浓度为1、5、10、20、50、100、200 µg/mL的溶液。

2.4 红芪多糖对rBMSCs细胞和ROBs细胞增殖的影响

分别取处于对数生长期的rBMSCs细胞和ROBs细胞，以1×104/孔接种于96孔板，细胞贴壁后，分别加入100 µL HPS-1（5、10、20、50、100、200 µg/mL）、HPS-2（5、10、20、50、100、200 µg/mL）、HPS-3（5、10、20、50、100、200 µg/mL），对照组加入不含药物的培养基，培养24 h或48 h，避光加入10 µL MTT，孵育4 h，弃去培养基，加入100 µL DMSO，振荡溶解结晶，用酶标仪测定490 nm处吸光度值。

2.5 红芪多糖对rBMSCs细胞和ROBs细胞ALP活性的影响

分别取第1代rBMSCs细胞和ROBs细胞，以1×104/孔密度接种于12孔板，细胞生长接近融合时，更换成骨诱导培养基（含1×10−8mol/L地塞米松、10 mmol/L β-甘油磷酸钠、50 mg/L抗坏血酸），分别加入100 µL HPS-1（5、10、20、50、100、200 µg/mL）、HPS-2（5、10、20、50、100、200 µg/mL）、HPS-3（5、10、20、50、100、200 µg/mL），对照组加入不含药物的培养基，每3天更换1次诱导培养基，连续培养8 d后，按照ALP试剂盒说明书检测ALP活性[7]。

2.6 红芪多糖对rBMSCs细胞和ROBs细胞钙化结节的影响

分别取第1代rBMSCs细胞和ROBs细胞，以1×104/孔密度接种于12孔板，待细胞生长接近融合时，更换成骨诱导培养基，rBMSCs细胞分别加入100 µL HPS-1（50 µg/mL）、HPS-2（50 µg/mL）、HPS-3（50 µg/mL），ROBs细胞分别加入100 µL HPS-1（20 µg/mL）、HPS-2（20 µg/mL）、HPS-3（20 µg/mL），对照组加入不含药物的培养基，每3天更换1次培养液，连续培养12 d，采用选择性结合钙的茜素红染色法检测钙化结节的形成情况，并使用Image-Pro Plus 6.0软件统计钙化结节染色阳性区域的面积和数量。

2.7 统计学分析

3 结果

3.1 3种红芪多糖对rBMSCs细胞和ROBs细胞增殖的影响

如表1所示，与对照组比较，20、50 µg/mL HPS-1显著促进rBMSCs和ROBs细胞增殖（＜0.05、0.01）；HPS-2和HPS-3对rBMSCs和ROBs细胞增殖没有促进作用，且200 µg/mL HPS-2显著抑制rBMSCs细胞增殖（＜0.05、0.01），200 µg/mL HPS-3显著抑制rBMSCs和ROBs细胞增殖（＜0.05、0.01）。

与对照组比较：*＜0.05**＜0.01，下表同

*< 0.05**< 0.01control group, same as below tables

3.2 3种红芪多糖对rBMSCs细胞和ROBs细胞ALP活性的影响

ALP活性的提高是骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的重要标志。如表2所示，与对照组比较，50、100 µg/mL HPS-1显著升高rBMSCs细胞中ALP活性（＜0.01），10、20、50 µg/mL HPS-1显著升高ROBs细胞中ALP活性（＜0.05、0.01）；200 µg/mL HPS-2显著降低rBMSCs细胞中ALP活性（＜0.01）；50 µg/mL HPS-3显著升高rBMSCs细胞中ALP活性（＜0.05），50 µg/mL HPS-3显著升高rBMSCs细胞中ALP活性（＜0.05），200 µg/mL HPS-3显著降低rBMSCs细胞和ROBs细胞中ALP活性（＜0.05、0.01），100 µg/mL HPS-3显著降低ROBs细胞中ALP活性（＜0.01）。

3.3 3种红芪多糖对rBMSCs细胞和ROBs细胞钙化结节形成的影响

钙化结节的形成是成骨细胞成熟的标志之一。如图1所示，与对照组比较，HPS-1（50 µg/mL）显著增加rBMSCs细胞中钙化结节的数量和面积（＜0.01），HPS-2（50 µg/mL）显著减少rBMSCs细胞中钙化结节的数量（＜0.01），HPS-3对rBMSCs细胞钙化结节的形成没有影响。如图2所示，与对照组比较，HPS-1显著增加ROBs细胞中钙化结节的数量（＜0.01），HPS-2和HPS-3对ROBs细胞钙化结节的形成没有影响。

4 讨论

骨质疏松症是一种常见的系统性骨骼疾病，以骨密度降低和骨微观结构退化为特征，可导致骨骼无力、骨强度下降、骨脆性增加。国际骨质疏松基金会预计，2020—2050年，中国患有骨质疏松症的人数为2.87亿，骨量减少的人数可能高达5.33亿[8]。骨质疏松症的发病机制为多种因素促进骨组织的吸收，同时抑制骨组织的形成，骨重建平衡遭到破坏，破骨细胞骨吸收大于成骨细胞骨形成作用，因此增强成骨细胞活性或诱导骨髓间充质干细胞向成骨细胞方向分化对骨质疏松的防治具有重要意义[9-10]。

本研究探讨了3种红芪多糖（HPS-1、HPS-2、HPS-3）对rBMSCs细胞和ROBs细胞增殖、分化和矿化的影响，发现3种红芪多糖（5、10、20、50 µg/mL）均不会对rBMSCs和ROBs细胞产生毒性，20、50 µg/mL HPS-1可促进细胞增殖。ALP和钙化结节可分别作为成骨分化早期和晚期的标志，本研究表明HPS-1能明显促进2种细胞ALP活性和矿化结节的形成，HPS-2和HPS-3对2种细胞成骨分化没有显著促进作用，甚至产生负性作用；50 µg/mL HPS-1对rBMSCs细胞的促进作用较大，20 µg/mL HPS-1对ROBs细胞的促进作用较大。课题组前期研究结果发现，3种红芪多糖均由鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖5种单糖组成，但HPS-1主要由葡萄糖组成（87.41%），HPS-2和HPS-3主要由阿拉伯糖和半乳糖组成；HPS-2相对分子质量最大，为1.420×105，HPS-3次之，HPS-1最小，为9.336×103；HPS-1的糖苷键为α构型，HPS-2和HPS-3主要为β构型[3]。因此，推测3种红芪多糖对rBMSCs和ROBs细胞成骨分化活性的差异可能与其单糖基组成、相对分子质量、结构和构象有关。综上，HPS-1具有一定的成骨活性，具有潜在的增强骨骼强度的能力，为骨质疏松的治疗提供了新的思路。

利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突

[1] 师志强, 张雪梅, 薛志远, 等. 红芪多糖3的荧光标记及其组织分布研究[J]. 西北药学杂志, 2018, 33(5): 611-615.

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[3] 杨秀艳, 薛志远, 杨亚飞, 等. 红芪多糖的复合酶联合超声提取工艺、理化特性及抗氧化活性的研究[J]. 中国中药杂志, 2018, 43(11): 2261-2268.

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[6] 方瑶瑶, 薛志远, 杨秀艳, 等. 红芪中5种黄酮类成分对大鼠骨髓间充质干细胞和成骨细胞成骨分化的影响[J]. 中草药, 2019, 50(3): 632-638.

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Effects of hedysarum polysaccharides on osteogenic differentiation of rBMSCs and ROBs

ZHAO Liang-gong1, 2, FANG Yao-yao3, LIU Xiao-hua3, FENG Shi-lan3

1. Gansu Provincial Key Laboratory of Bone and Joint Diseases, Lanzhou 730000, China 2. Lanzhou University Second Hospital, Lanzhou 730000, China 3. School of Pharmacy, Lanzhou University, Lanzhou 730000, China

To investigate the effects of hedysarum polysaccharides (HPS-1, HPS-2, HPS-3) on promoting osteogenic differentiation of rat bone marrow stromal cells (rBMSCs) and rat calvarial osteoblasts (ROBs).MTT assay was used to detect the proliferation of rBMSCs and ROBs. Alkaline phosphatase (ALP) activity of rBMSCs and ROBs were detected by ALP kit. Mineralized nodule formation of rBMSCs and ROBs was detected by alizarin red S staining.HPS-1 (20, 50 µg/mL) significantly promoted the proliferation of rBMSCs (< 0.05, 0.01), HPS-1 (20 µg/mL) significantly promoted the proliferation of ROBs (< 0.01), HPS-2 and HPS-3 had no influence on promoting the proliferation of rBMSCs and ROBs. HPS-1 (50, 100 µg/mL) significantly increased ALP activity in rBMSCs (<0.01), HPS-1 (10, 20, 50 µg/mL) significantly increased ALP activity in ROBs (<0.05, 0.01), HPS-3 (50 µg/mL) significantly increased ALP activity in rBMSCs (<0.05). HPS-2 had no influence on increasing ALP activity in rBMSCs and ROBs. HPS-1 significantly increased the area and number of calcified nodules of rBMSCs and ROBs (<0.01), HPS-2 and HPS-3 had no influence on promoting the formation of calcified nodules of rBMSCs and ROBs.HPS-1 could enhance the cell activity and osteogenesis-related factor expression, and significantly promote the differentiation and mineralization of rBMSCs and ROBs cells.

hedysarum polysaccharides; osteogenic differentiation; bone marrow stromal cells; calvarial osteoblasts; alkaline phosphatase

R285.5

A

0253 - 2670(2021)02 - 0432 - 05

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.02.016

2020-07-10

国家自然科学基金资助项目（81703664）

赵良功（1986—），男，博士，主治医师，从事骨关节退行性疾病的治疗。E-mail: Lzxtj2008@hotmail.com

封士兰（1957—），博士，教授，从事中草药及中药制剂中化学成分分离分析研究。E-mail: fengshl@lzu.edu.cn

[责任编辑 李亚楠]