固定化光合细菌转化预水解液(PHL)的制氢研究

陈 朵， 王雪青*， 张安龙， 罗 清， 王浩楠

(1.陕西科技大学 轻工科学与工程学院 轻化工程国家级实验教学示范中心， 陕西 西安 710021； 2.陕西科技大学 环境科学与工程学院， 陕西 西安 710021 )

0 引言

溶解浆厂是木质纤维素的主要利用者之一[1]，基于生物质精炼的原则在硫酸盐法制浆前需对其进行预水解处理，以抽出原料中的半纤维素[2]，因此就如何充分对预水解液中的半纤维素高值化利用已成为当前生物质精炼的热点[3,4].目前,对半纤维素的利用主要集中在发酵制取乙醇、乙酸、糠醛和木糖醇等物质[1,2].但是,普遍存在底物转化效率低的问题，主要原因是预处理过程产生的糖类或木素在高温和酸性条件下转化为乙酸、糠醛及酚类等物质[5,6]，这些抑制剂对微生物的生长存在严重的抑制作用.利用光合细菌处理预水解液目前尚未见报道，由于光合细菌具有灵活的代谢方式和较高的底物适应性和耐受性[7]，其可以利用预水解液中木糖和乙酸等主要碳源，在废水去污的同时实现了有机物的能源转化.

Jiaqi Chen等[8]对光合细菌处理废水的应用范围、生物降解途径以及生物反应器模型进行了综述，提出以光合细菌为基础的技术是满足废水处理可持续发展的潜在替代方法.本课题组[9]前期对光合细菌转化秸秆解聚液的制氢特性进行了研究，发现光合细菌利用水解液具有很好的产氢潜力，最大产氢量为3 944.2 mL/L，且反应迟滞时间相对较短.Walailak Pattanamanee等[10]选用葡萄糖、木糖和醋酸为主要成分进行混合碳源光发酵产氢的研究，发现在使用水解产物进行光发酵制氢时，气体产量高度依赖于混合碳基质的组成.以上研究结果均表明预水解液作为光合细菌产氢底物的有效可行性.

在预水解液作为底物时，为了克服预水解液中抑制剂的问题，需进行发酵前脱毒处理，常用的方法如离子交换[2,11]或灰碱处理[3]等，但是既增加了成本也造成了可利用糖分的损失[12].固定化微生物技术以其为微生物提供更多的保护、简单的细胞活化和良好的操作稳定性[13]等优势引起研究者的广泛关注.但是在选择固定化材料时，需满足无毒、简单易得和物化性能稳定等条件[14].以下三种材料海藻酸钠、琼脂和卡拉胶均为来源于大自然的生物大分子，对微生物无毒性.海藻酸钠是从褐藻或马尾藻中提取碘和甘露醇之后的副产物，当遇到Ca2+时会形成水凝胶，其网络互传结构使其具有良好的成球性和稳定性[15]；琼脂是从海藻中提取的多糖体[16]，因其较高的稳定性和良好的生物亲和性被视为固定化的理想载体；卡拉胶是从藻类提取出的一种天然凝固剂，具有很好的透明度和稳定性[17].用这三种材料对光合细菌进行固定化，成本较低且操作易行.

本文以光合细菌HY01为目标菌株，通过几种天然高分子聚合材料及其复合物的透光性、化学稳定性等性能的比较，遴选出最佳的光合细菌固定化包埋载体，并对其固定化条件进行优化.之后对固定化的光合细菌在模拟预水解液中进行产氢特性分析，分析固定化细菌的产氢性能、对碳源的利用能力、对毒性物质的耐受性以及其循环特性.固定化光和细菌转化预水解液制氢不仅实现了光发酵一步法转化制氢，而且为预水解液的高值化利用提供了新的途径.

1 实验部分

1.1 实验菌株和培养条件

1.1.1 实验菌株

实验使用的光发酵产氢菌株球形红细菌RhodobactersphaeroidesHY01为实验室保藏菌种.

1.1.2 培养条件

(1)MPYE生长培养基 (/L)：CaCl21 g，MgCl21.6 g，酵母提取物 3 g，鱼粉蛋白胨 3 g.

(2)MedA产氢培养基 (/L)：D-木糖 6 g，L-谷氨酸 1.25 g，10% NaCl 10 mL，氮川三乙酸 10 g，CaCl23.33 g，MgSO4·7H2O 29.5 g，(NH4)6Mo7O24·4H2O 93 mg，FeSO4·7H2O 99 mg，微量元素溶液20 mL，溶液灭菌后用微孔滤膜加入维生素溶液10 mL，磷酸盐缓冲溶液20 mL.

(3)模拟预水解液的组成 (/L)：木糖、乙酸和苯酚碳的摩尔质量分别为162.5 mmol、25 mmol和12.5 mmol.

1.2 实验菌株和培养条件

1.2.1 光合细菌的活化与富集

在-80 ℃低温储存箱中取出冻存液，通过双层平板划线法，用纯木质接种棒蘸取冻存液进行平板划线，在恒温培养箱中培养72 h，挑取平板上的单菌落接种至25 mL的MPYE生长培养液中，将离心管置于30 ℃，200 rpm恒温摇床中富集培养，培养至对数生长期取出，调节菌液吸光度OD600=0.8±0.02，离心收集菌体备用.

1.2.2 固定化载体的制备与选择

分别配备海藻酸钠、琼脂、卡拉胶凝胶，用注射器缓慢吸取凝胶，避免产生气泡，悬空滴加到交联剂中形成小球即为载体的制备.固定好的小球用磷酸盐缓冲溶液冲洗三遍.对固定化载体进行透光性、机械强度和重复性等性能评判，综合选择最佳的固定化载体.

1.2.3 固定化光合细菌微球的优化和产氢

设置琼脂-卡拉胶不同的体积比例:2∶4、2.5∶3.5、3∶3、3.5∶2.5、4∶2；不同的交联剂浓度：1%、 2%、3%、4%；不同的细菌接种量：10 mL、20 mL、30 mL、40 mL、50 mL；不同的固定化时间：30 min、60 min、90 min、120 min，来探究光合细菌固定化时的最佳条件.

1.3 分析方法

采用比浊法对培养液中的生物量进行测定(OD600)；固定化颗粒的透光性参考张念一等[18]的方法，采用拉压力测试仪测定固定化载体的机械强度； DNS法[19]测定培养液中还原糖的含量；4-氨基安替比邻比色法来测定苯酚的含量[20].所有实验均设置三个平行样.

2 结果与讨论

2.1 光合细菌固定化载体SEM形貌特征

分别采用海藻酸钠、琼脂粉、卡拉胶、海藻酸钠-琼脂和琼脂-卡拉胶制作固定化小球，其SEM形貌如图1所示.

(a)海藻酸钠载体 (f)海藻酸钠固定的HY01

(b)琼脂载体 (g)琼脂固定的HY01

(c)卡拉胶载体 (h)卡拉胶固定的HY01

(d)海-琼复合载体 (i)海-琼固定的HY01

(e)琼-卡复合载体 (j)琼-卡固定的HY01图1 不同材料及其固定化HY01的SEM图

图1(a)～(e)表示没有负载细菌时固定化载体.可以看出,海藻酸钠(如图1 (a)所示)的形貌为较为细小的丝网状结构，但是形态结构不太规则；琼脂(如图1 (b)所示)的结构为较为规则的层状结构，并且表面光滑，但光滑的表面会减少细菌的附着点；卡拉胶(如图1 (c)所示)具有网状结构的形貌，网孔大小从100μm到400μm不等；海藻酸钠-琼脂复合固定化载体(如图1 (d)所示)和单一琼脂的表面结构相比，加入海藻酸钠后，琼脂表面变得粗糙但仍保持其原有的结构；从图1 (e) 可以明显地看出，琼脂-卡拉胶固定化载体同时具备琼脂的层状规则孔隙和卡拉胶的网状结构，卡拉胶的添加，缩小琼脂层状大孔结构的同时，也为细菌的固定化提供了更大的比表面积.

图1(f)～(j)表示固定化载体上的光合细菌分布情况.五种不同固定化载体的细菌分布具有很明显的差异，琼脂凝胶上的光合细菌(如图1 (g)所示)数量明显少于其他几种固定化载体，原因是琼脂的结构特点造成了细菌有较为严重的泄露；光合细菌在海藻酸钠中(如图1 (f)所示)虽然可以稳定的生长增殖，但是其自身对pH的敏感性[21]导致在循环利用时便会出现颗粒变软甚至破碎的现象，这将对固定化实验带来很不利的影响；海藻酸钠-琼脂固定的光合细菌(如图1 (i)所示)出现明显的分布不均现象；琼脂和卡拉胶固定化载体(如图1 (j)所示)使得光合细菌均匀的固定于载体当中，是固定化载体的良好选择.

2.2 光合细菌固定化包埋载体的选择

对于光合细菌来说，理想的固定化载体应该是具有无毒性、良好的透光性、较高的机械强度以及优良的可循环利用性等优点[22].

以木糖为唯一碳源时，固定化光和细菌的产氢结果如图2所示.实验结果可知，海藻酸钠和卡拉胶作为固定化载体时产氢量相近，但是随着时间的延长，小球的形态会变得疏松甚至破碎，说明可循环性较差.琼脂作为固定化载体时表现出良好的产氢性能，但游离的细菌对产氢量贡献较大.还观察到琼脂和卡拉胶混合后固定化细菌的产氢量和重复稳定性明显优于二者单独固定时性能.复合材料作为载体时通过键的断裂和结合或物理作用使得新的材料具有更好的机械性能和循环稳定性[23].

图3为不同载体固定化小球的机械强度测试，琼脂凝胶具有足够大的机械强度，可达6.8 N；卡拉胶在单独作为固定化载体时机械强度较低，当琼脂和卡拉胶复合之后的机械强度界于二者单独使用时之间.

图4表示固定化小球的透光性测试，良好的透光性有助于光合细菌增加传质效率，卡拉胶的透光性明显大于其他载体材料，同时还发现，琼脂和卡拉胶复合之后的透光性比琼脂提高了2.8倍.

由于各类废水的化学条件都比较复杂，对不同材料固定化小球的化学稳定性进行测试如表1所示，当固定化小球在酸性和盐性环境中停留4 h之后，海藻酸钠小球会变得易碎且结构松散；琼脂-卡拉胶复合的化学稳定性比较稳定.综合比较而言，卡拉胶具有良好的透光性，并且化学稳定性适中；琼脂作为固定化载体时化学稳定性较好，且在循环使用中表现出稳定的产氢性能；鉴于二者的优点，将琼脂和卡拉胶复合作为固定化材料时，不仅解决了琼脂透光性较差的缺陷同时，还减少细菌的泄露，而且复合材料固定化光合细菌体现出了较强的产氢性能和稳定的循环利用性.

图2 不同材料化固定HY01的产氢结果图

图3 不同固定化材料的机械强度

图4 不同固定化材料的透光率

表1 固定化材料的化学稳定性比较

2.3 光合细菌固定化条件的优化

以琼脂-卡拉胶为固定化载体，对其最佳的固定化条件进行优化，结果如图5所示.实验操作为：将离心收集好的菌体加入到浓度分别为2%的琼脂-卡拉胶的混合凝胶中(共6 mL),采用涡旋仪震荡混合均匀，用注射器缓慢吸取5 mL，避免产生气泡，滴加小球到KCl交联剂中固定化，固定化之后的微球用磷酸盐缓冲溶液冲洗三遍，产氢反应在50 mL注射器中进行.选择细菌接种量、固定化时间、交联剂浓度和琼脂-卡拉胶的配比进行实验，最终确定最佳的固定化条件.

2.3.1 接种量对固定化产氢的影响

取OD660为0.8±0.02的菌液离心后与琼脂-卡拉胶凝胶混合均匀，制作小球进行产氢.如图5 (a) 所示，当接种量过低时，光合细菌生长缓慢，导致产氢量较低；而当接种量为50 mL时，细菌在培养基中对营养物质进行竞争.因此，选用40 mL的细菌接种量进行实验.

2.3.2 固定化时间对固定化产氢的影响

固定化时间对固定化载体的强度和细菌活力都会产生影响，固定化时间太短可能会导致载体强度不够、容易破碎、细菌容易泄露；固定化时间过长使凝胶结构太致密，不利于细菌对底物的利用[14].从图5 (b) 可以看出，固定化时间对产氢量的影响不是很大，但是随着固定化时间的延长，产氢量出现先上升后下降的趋势，且在固定化时间为60 min的时产氢量最高.因此选取60 min为后续实验的固定化时间.

2.3.3 交联剂浓度对固定化产氢的影响

κ型卡拉胶由于结构单元富含硫酸酯键-O-SO3-，因此可与交联剂KCl中的K+共价结合形成结构稳定的凝胶，K+浓度对固定化载体的强度和细菌的活性会产生较大的影响[14].如图5 (c) 所示，当KCl浓度较低时，产氢量较低，因为制备的固定化载体结构不稳定，容易破裂.当交联剂浓度过高时，产氢量出现快速下降，是因为固定化载体的结构比较致密，传质性能变差；另外过高的K+浓度可能会导致细菌的细胞膜内外出现浓度差，会对细菌造成伤害.因此最终选择交联剂浓度为2%.

2.3.4 琼脂-卡拉胶配比对固定化产氢的影响

图5 (d) 为琼脂和卡拉胶在不同配比下固定化光合细菌的产氢量对比，当卡拉胶比例过高时(2∶4)，产氢量明显降低.过多的卡拉胶对琼脂形成了包覆作用，再加以KCl的交联作用使得载体表面形成了坚硬的包覆膜，严重影响了细菌的生长和底物的传质性能.当琼脂配比过高时(4∶2)，在产氢的体系中有较高的细菌浓度，说明细菌有明显的泄露.因此选择3∶3的配比进行后续实验.

(a)细菌接种量

(b)固定化时间

(c)交联剂浓度

(d)琼脂-卡拉胶配比图5 光合细菌固定化产氢条件的优化

2.4 木糖和苯酚混合物作为碳源时固定化细菌的产氢性能

在硫酸盐预水解液中存在少量的酚类物质(约1～2 g/L)[24]，通常用苯酚作为模型化合物来替代酚类物质.前期实验得知游离光合细菌对苯酚的耐受阈值为500 mg/L，因此选用500 mg/L的苯酚与木糖作为双碳源进行产氢性能的探究.如图6所示，初期光合细菌对底物的利用受到传质效率等因素的限制，基质不能达到固定化小球内部[25]，导致产氢量较低，苯酚和木糖的利用效果不明显.然而，在2～4次循环产氢时，产氢量有明显的提升，第二次的累积产氢量可达到3 463.2 mL/L，木糖利用率(95.7%)和苯酚降解率(24.3%)也达到最大值.可见固定化的光合细菌对产氢基质有很好的适应性和利用性，并且重复使用6次后产氢量为2 230.8 mL/L，具有很好的稳定性.相比于游离态细菌产氢(pH=5.9)，固定化之后的细菌的对系统的pH有更大的适应范围(pH=4.88)，此结论与孙丽慧等[15]的实验发现相一致.

(a)以木糖-苯酚为碳源时固定化细菌的产氢量和pH值

(b)木糖和苯酚混合碳源时底物的利用率图6 木糖-苯酚为碳源时固定化 细菌的产氢性能

2.5 固定化光合细菌利用PHL产氢SEM图

以固定的琼脂-卡拉胶微球为研究对象，对其进行电镜扫描如图7所示.从图7(a)～(c)可以观察到，琼脂-卡拉胶微球直径约4 mm；未固定光合细菌的琼脂-卡拉胶凝胶珠表面光滑，这些交联形态在光合细菌加入之后变得粗糙.图7(d)是在模拟PHL中产氢反应两个循环周期后的固定化微球的断面图图像，可以看出长时间的培养产氢使细胞显著生长，从而占据了整个微球的内表面，这表明细菌在微球内具有很高的生物附着量.

(a)琼脂-卡拉胶微球的形貌图 (b)琼脂-卡拉胶微球的断面结构 (c)琼脂-卡拉胶微球负载细菌后断面结构 (d)循环2次后断面图 (e)细菌的分布图图7 固定化细菌微球的SEM图

2.6 模拟PHL为碳源时的产氢性能

图8(a)～(e)分别表示固定化光合细菌在PHL中的累计产氢量、末端pH值、溶液中的游离细菌浓度、苯酚和木糖利用率的对比图.

(a)产氢量 (b)产氢结束培养液的pH值 (c)游离细菌浓度 (d)苯酚利用率 (e)木糖利用率图8 以模拟PHL为碳源时固定化 细菌的产氢性能

首先，与游离态光合细菌利用PHL产氢相比，初始固定化的细菌不如游离态时的产氢量大(6 420.6 mL/L)，但在重复第二次实验时，产氢量要大于游离状态，并且第三次和第四次重复时仍然表现出较为稳定的产氢性能(如图8(a)所示)；其次，发酵产氢末端的pH值维持在6.3～6.4 (如图8(b)所示)，产氢量的增加与产氢过程中培养液的pH值较为稳定有很大的关系.在PHL产氢系统中，除了木糖作为主要碳源之外，还存在一定的小分子酸，乙酸的转化利用会提高系统的pH，两种碳源的协同作用让产氢系统更稳定，产氢周期更长，产氢量更大；值得一提的是系统中苯酚的去除率最大可达到28.5%，木糖利用率相对比较稳定，基本上都在95%以上(如图8(d)和8(e)所示)；最后，对产氢结束的细菌浓度进行测量，可以看出在整个循环过程中细菌泄露量较少(如图8(c)所示)，说明所制备的固定化载体具有很好的循环使用性能，具有很好的应用前景.

3 结论

本文通过比较不同天然高分子聚合物固定化材料海藻酸钠、琼脂、卡拉胶等作为载体来固定光合细菌，从细菌的生长适应性、透光性、机械强度和稳定性等方面确定了最佳的固定化材料为琼脂-卡拉胶，而后通过条件优化得出最佳固定化条件.并研究了木糖和500 mg/L苯酚作为底物时的产氢性能，重复六个周期都具有比较稳定的产氢性能，且固定化细菌和游离态细菌相比对苯酚的耐受性有明显提升.

最后，对固定化光合细菌在模拟PHL中的产氢性能进行研究，得知木糖利用率可达99.4%，苯酚降解率为28.5%，并且预水解液中的复合碳源对系统的pH具有自平衡作用是产氢性能提高的另一个原因.固定化光合细菌转化预水解液制氢不仅实现了光发酵一步法制氢，而且为预水解液的高值化利用提供了一定的理论基础.