SPF小鼠上呼吸道常见细菌的分离鉴定及携带率分析

魏天文 胡芹宝 宣俊文 李晨江 周小江 吕 铭 张新创

(兰州生物制品研究所有限责任公司 甘肃省疫苗工程技术研究中心，兰州 730046)

《实验动物微生物学等级及监测》国家标准是按实验动物自身所携带的病原微生物或条件致病和对科学实验干扰大的病原，将实验动物分为普通级动物conventional(CV)animal、清洁动物clean(CL)animal、无特定病原体动物specific pathogen free(SPF)animal、无菌动物 germ free(GF)animal[1]。其中，细菌检测的采样来源于气管分泌物、肠内容物两个部位。常规检测流程是：采样、分离培养、生化鉴定、血清学检测等步骤，最终以能否检出国家标准中需排除的病原微生物来判定是否符合相应级别实验动物。至于分离到的其他细菌，国家标准中未作鉴定要求，通常不再做鉴定。自2016年以来我们对本单位SPF小鼠繁殖单元进行常规细菌检测时，除检测国标中要求检测的细菌外，对小鼠上呼吸道分离到的细菌均进行了分离鉴定和统计，累计检测KM小鼠640只，NIH小鼠160只，BALB/c小鼠160只，得出了SPF小鼠的上呼吸道常见细菌及携带率。

1 材料和方法

1.1 实验动物

SPF小鼠均由本所实验动物室生产，实验动物生产许可证号：SCXK(甘)2017-0001。体质量18～22 g。

1.2 主要试剂与仪器

鲜血营养琼脂培养基(血平皿)、麦康凯培养基、三糖铁培养基均由本所培养基室提供或自制；细菌微量生化反应管、革兰氏染液购自杭州滨和微生物试剂有限公司，生产许可证号：浙食药监械生产许20100290；Vitek 2 compact全自动细菌鉴定分析仪(法国生物梅里埃公司)；Vitek 2 compact革兰氏阳性球菌GP鉴定卡；Vitek 2 compact革兰氏阴性菌GN鉴定卡、生物安全柜、超净工作台、恒温培养箱和显微镜。

1.3 采样

小鼠采血样后处死，在生物安全柜内无菌解剖取咽、喉部气管分泌物接种在血平皿培养基上，放入(37 ± 1)℃恒温培养箱培养18～24 h。

1.4 分离鉴定

在超净工作台内肉眼观察上述培养物的菌落形态，挑取单颗菌落涂片，革兰氏染色镜检，挑取单个菌落用血平皿培养基分纯培养，分纯的培养物用麦康凯培养基、三糖铁培养基及生化反应管等传统方法进行鉴定。同时按照镜检结果分别采用Vitek 2 compact革兰氏阳性菌GP鉴定卡、Vitek 2 compact革兰氏阴性菌GN鉴定卡进行全自动生化鉴定。

2 结果

2.1 小鼠气管分泌物检测及菌群培养

对SPF小鼠气管分泌物进行细菌培养鉴定发现，其上呼吸道常见细菌有8种。细菌在血平皿上培养24 h的菌落形态如图1所示，革兰氏染色的菌体形态如图2所示。

图1 细菌在血平皿上培养24 h的菌落形态注：A.毗邻颗粒链菌；B.松鼠葡萄球菌；C.木糖葡萄球菌；D.大肠埃希氏菌；E.阴沟肠杆菌Fig.1 The colony morphology of bacteriacultured on blood plates for 24 hoursNote: A. Granulicatella adiacens；B. Staphylococus sciuri；C. Sta.xylosus； D.Escherichia coli；E. Enterobacter cloacae

图2 革兰氏染色的菌体形态Fig.2 The mycelial morphology in Gram staining

2.1.1毗邻颗粒链菌(Granulicatellaadiacens)：在血平皿上培养24 h菌落形态呈针尖大小，周边有轻微溶血或不明显。革兰氏染色短链状或长链状阳性球菌或杆菌，也有部分单个、成双的散在排列。Vitek 2 compact全自动细菌鉴定结果提示可信度93%。

2.1.2松鼠葡萄球菌(Staphylococussciuri)：在血平皿上培养24 h菌落形态呈1～2 mm淡黄色菌落)，不溶血。革兰氏染色阳性球菌，呈葡萄串状排列。Vitek 2 compact全自动细菌鉴定结果提示可信度99%。

2.1.3木糖葡萄球菌(Sta.xylosus)：在血平皿上培养24 h菌落形态呈0.5～1 mm白色菌落，不溶血。革兰氏染色阳性球菌，呈葡萄串状排列。Vitek 2 compact全自动细菌鉴定结果提示可信度91%。

2.1.4阴沟肠杆菌(Enterobactercloacae)：在血平皿上培养24 h菌落形态呈3～4 mm大而湿润的黏液状菌落，不溶血。麦康凯琼脂上为淡粉红色菌落。革兰氏染色阴性粗短杆菌。Vitek 2 compact全自动细菌鉴定结果提示可信度99%。

2.1.5奇异变性杆菌(Proteusmirabilis)：在血平皿上培养24 h菌落形态呈扩散生长或呈迁徙生长，有特殊臭味。革兰氏染色阴性杆菌。Vitek 2 compact全自动细菌鉴定结果提示可信度99%。

2.1.6大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)：在血平板上培养24 h菌落形态呈3～4 mm灰白色或略带一些棕黄色菌落，不透明，菌落表面湿润。革兰氏染色阴性粗短杆菌。麦康凯琼脂上为粉红色菌落。Vitek 2 compact全自动细菌鉴定结果提示可信度96%。

2.1.7不动杆菌(Acinetobacter)：在血平板上培养24 h菌落形态呈2～3 mm灰白色菌落，不透明，菌落表面湿润。麦康凯琼脂上为无色菌落。革兰氏染色阴性杆菌。Vitek 2 compact全自动细菌鉴定结果提示可信度94%。

2.1.8肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae)：在血平板上培养24 h呈菌落形态3～4 mm灰白色黏液状菌落，菌落表面湿润。麦康凯琼脂上为粉红色菌落。革兰氏染色阴性粗短杆菌。Vitek 2 compact全自动细菌鉴定结果提示可信度99%。

2.2 SPF小鼠上呼吸道常见细菌检出数及携带率

检测结果见表1所列。

表1 SPF小鼠的呼吸道常见细菌检出数及携带率Table 1 The quantity and carrying rate and of commonbacteria in the respiratory tract of SPF mice

3 讨论

《实验动物微生物学等级及监测》国家标准中规定的SPF小鼠必须检测及必要时检测项目共有16项，均为病原微生物或条件致病和对科学实验干扰大的病原，实际情况下SPF小鼠上呼吸道携带有大量的细菌，分离鉴定这类细菌并了解其携带率，有助于SPF小鼠群体的微生物质量评估，也为相关科研项目选择使用SPF小鼠时提供数据支持。

本研究就本单位自2016年以来对SPF小鼠繁殖单元进行常规细菌检测时，对采集到的上呼吸道细菌均做了进一步的鉴定，得到SPF小鼠上呼吸道常见细菌及携带率，从细菌携带率看大致可分为四类情况。第一类：毗邻颗粒链菌，携带率高达98.6%，几乎每只小鼠均携带；第二类：松鼠葡萄球菌、木糖葡萄球菌，携带率45%～65%；第三类：包括阴沟肠杆菌、大肠埃希氏菌、奇异变性杆菌，携带率25%～45%；第四类：包括不动杆菌、肺炎克雷伯菌等，携带率10%以下。按照国家标准规定不同繁殖单元的要求，群体在100～500只，采样量不少于10只，则每次检测前三类细菌均能检出，携带率也稳定在一个区间内。证明这几种细菌在小鼠上呼吸道属于一种常态存在。

四类细菌大多为非致病菌或正常菌群，很少看到有实验小鼠感染这类细菌引起疾病的报到。但人有感染毗邻颗粒链菌、松鼠葡萄球菌引起败血症的报道[1-2]；而阴沟肠杆菌更是医院感染的重要病原菌[3]；人感染这类细菌的原因常常是病人已有基础病，自身免疫力下降或菌群失调引起；奇异变性杆菌在小鼠上分离报道多与实验动物微生物检测相关[4]；不动杆菌广泛分布于外界环境中，分离鉴定过程中能检出琼氏不动杆菌、鲁氏不动杆菌及鲍氏不动杆菌；大肠埃希氏菌是人和动物肠道中的正常栖居菌，能检出也属于正常。

肺炎克雷伯菌是国标中要求SPF小鼠必须排除的细菌，从检出结果看NIH小鼠繁殖单元、BALB/c小鼠繁殖单元均有检出，检出率不足3%。这个检出率和刘丽达等[5]报道的结果相近，此菌在长达几年的检测过程中，有时能检出，有时检不出，说明该菌在整个动物群体中始终处于一种低水平携带状态，并没有因为有检出而出现携带率上升的趋势，如按照现行国家标准只要有检出就判定这个群体达不到SPF标准，但从另外一个角度我们认为对于这种人和动物呼吸道和消化道寄生性条件致病菌[6]，是否可以用一种定量的标准，如以携带率为限定，用来判定动物群体是否符合标准更客观一些？

分离培养、生化鉴定是细菌检测的经典方法，虽然受各种因素的制约，灵敏度受影响，但检测结果的准确性使此方法一直都在沿用。这几年来只是常规检测，没有涉及到微需氧菌和厌氧菌的培养，因此得到的结果均为需氧菌并且只限于上呼吸道。作为实验动物生产单位，在提供实验动物质量合格证的同时若能再附一份全方位的实验动物常见细菌及携带率等相关信息，将更有助于为SPF小鼠群体的微生物质量评估及相关科研项目选择使用SPF小鼠时提供支持，这些工作有待于以后逐步完善。