正交试验优选微波辅助提取火麻仁多糖的工艺

陈晓辉 陈雨婕 闻正顺

摘要 [目的]对火麻仁内的多糖进行微波辅助提取并优化提取工艺，同时对比热水提取法与微波辅助提取法的提取率差异。[方法]采用单因素和正交试验对提取时间、微波功率和液料比3个因素进行优化，确定微波提取火麻仁的最佳条件，并与热水提取法进行比较。[结果]微波提取的最佳条件为微波功率250 W，提取时间6 min，液料比60∶1（mL/g）。通过正交试验和试验因素的方差分析可知，微波功率对火麻仁多糖的提取率影响最大，其次为时间和液料比。通过对比试验可以发现，采用微波提取火麻仁多糖的效果明显优于热水提取法，其中微波冻融提取效果最好，提取率为11.11%，而热水提取率仅为4.35%。 [结论]该研究优化了微波辅助提取火麻仁多糖的工艺，提高了多糖提取率，同时缩短了提取时间，为火麻仁多糖相关生物活性的进一步研究提供了支持。

关键词 火麻仁;多糖;微波辅助提取;正交试验

Abstract [Objective]Microwave-assisted extraction of polysaccharides in hemp seed and optimization of the extraction process were studied，while compared the difference in extraction rate between hot water extraction and microwave-assisted extraction.[Method]Three factors of extraction time，microwave power，and material-to-liquid ratio were selected by single factor and orthogonal experiments，then the best conditions for microwave extraction of hemp seed were determined and compared with hot water extraction method.[Result]The best conditions for microwave extraction were microwave power 250 W，extraction time 6 min，and liquid-solid mass ratio of water to hemp seed 60∶1.Among them，the orthogonal experiment and the variance analysis of the experimental factors showed that the microwave power had the greatest influence on the extraction rate of hemp seed polysaccharides，followed by time and solid-liquid mass ratio.Through the comparative experiments，the effect of microwave extraction of hemp seed polysaccharides was significantly better than that of hot water extraction.The microwave freeze-thaw extraction，seffect was the best，the extraction rate was 11.11%，and the hot water extraction rate was only 4.35%.[Conclusion]This study optimized the microwave-assisted extraction process of hemp seed polysaccharides，improved the extraction rate of polysaccharides，and shortened the extraction time，which provided support for further research on the biological activities of hemp seed polysaccharides.

Key words Hemp seed;Polysaccharides;Microuwave-assisted extraction;Orthogonal test

火麻仁，又名大麻仁、火麻、冬麻子等，喜濕喜温，性味甘平，临床上对于通便润燥、祛风痹、治疗丹毒等疗效显著[1]。火麻仁属双子叶植物纲，荨麻目，桑科;干燥时呈扁卵圆形，外果皮菲薄，内果皮坚脆[2]。研究发现，火麻仁含有30%油、25%蛋白质，以及多种膳食纤维、维生素和矿物质等[3-4]，是一种极具潜力的中药材。多糖广泛存在于各种植物及微生物之中，是一类重要的功能性碳水化合物，已被证明具有多种生理和生物活性[5-6];在过去的几十年中，多糖相关的结构修饰研究日益深入[7-8]，到如今，人们已经熟练掌握了合成定制多糖的技术[9]，但天然来源的多糖因其更具有亲和性以及更易吸收代谢而仍在多糖研究、药物释放系统乃至纳米工程材料研究等领域占有重要地位[10-11]。有研究表明，火麻仁多糖对于环磷酰胺所引起的鼠类肠道病变具有良好的修复作用，因此，其药用价值同样不容忽视[12]。笔者通过对火麻仁内的多糖进行微波辅助提取并优化其工艺，对比热水提取法与微波辅助提取法的提取率差异，确立最优提取工艺，以期为火麻仁多糖的进一步研究提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料 火麻仁原材料产自广西巴马县，已干燥。

1.2 试剂与仪器 试剂：无水乙醇（货号：10009218）、三氯甲烷（货号：10006818）、正丁醇（货号：10005208）、苯酚（货号：10015318）以及無水乙醚（货号：80059618）全部采购自国药集团化学试剂有限公司，均为分析纯。

仪器：中药粉碎机（103型，瑞安市永历制药机械有限公司）;大容量低速离心机（TD5K，长沙旺东实验仪器有限公司）;冷冻干燥机（FD-1E，北京德天佑科技发展有限公司）;恒温水浴锅（HH-S，巩义市予华仪器责任有限公司）;祥鹄电脑微波超声波组合合成/萃取仪（XH-300A，北京祥鹄科技发展有限公司）;紫外-可见分光光度计（UV-1600，上海美谱达仪器有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 火麻仁多糖的提取。

火麻仁去壳，粉碎，过40目筛，备用;乙醇乙醚混合（1∶1）后作为提取液对火麻仁干粉进行索氏提取脱脂，脱脂过程持续至提取液变无色。之后，取出火麻仁粉末残渣挥发溶剂并烘干。称取适量处理后的粉末，加入二次蒸馏水，调整不同微波功率与加热时间，分别进行提取。离心取上清液，浓缩至原体积的1/5，醇沉过夜。醇沉后溶液与Sevage试剂（正丁醇与氯仿1∶5）按5∶1混合，30 ℃搅拌30 min，离心，取下层清液。重复此操作直至离心后多糖溶液与Sevage试剂两液面分层处无杂质， 取下层清液，透析24 h后得火麻仁粗多糖。

1.3.2 多糖测定。采用葡萄糖标准曲线作为样品OD值的对照标准曲线，葡萄糖标准曲线为A=3.943 8c+0.095 3，R2=0.992 8。其线性有效范围为0～0.5 μg/mL。

采用苯酚硫酸法测定，提取率计算公式如下：提取率=（m×D×V/M）×100%

式中，m为火麻仁多糖提取液OD值对照标准曲线所得糖含量; D为稀释倍数; V为样品液总体积（mL）;M为投加的火麻仁干粉质量。每个样品做3组平行。

1.3.3 单因素对比。

1.3.3.1 提取温度对提取率的影响。微波提取：称取1.20 g脱脂后粉末6份，液料比50∶1（mL/g），固定提取时长2 h，将100 W作为起始功率，以50 W为梯度逐级增加。

热水提取： 称取1.20 g脱脂后粉末5份，液料比50∶1，固定提取时长2 h，将30 ℃作为起始温度，以10 ℃为梯度逐级增加。

1.3.3.2 提取时间对提取率的影响。微波提取：称取1.20 g脱脂后粉末7份，液料比与提取时间同“1.3.3.1”。功率设定为250 W，将2 min作为起始时间，以2 min为梯度逐级增加。

热水提取：称取1.20 g脱脂后粉末5份，液料比同“1.3.3.1”，提取温度设置为50 ℃。将1 h作为起始时间，以1 h 为梯度逐级增加。

1.3.3.3 液料比对提取率的影响。微波提取：称取1.20 g脱脂后粉末5份，微波功率为250 W，加热时间设置为6 min，将30∶1作为起始液料比，以10∶1为梯度逐级增加。

热水提取称取5.00 g处理过的火麻仁粉末5份，提取温度设置为50 ℃，将30∶1作为起始液料比，以10∶1为梯度逐级增加，加热2 h。

1.3.4 微波提取工艺的正交试验优化。经过单因素试验分析后，确定3个主要因素，因素水平见表1，正交试验设计见表2。

1.3.5 不同微波提取法与热水提取法提取率比较。分别设5种提取处理：处理①（热水提取）：将处理好的原料60 ℃水浴提取6 h，计算提取率;处理②（微波直接提取），将处理好的原料250 W微波提取6 min，计算提取率;处理③（微波一次浸泡提取），将处理好的原料在常温下浸泡2 h后，再用微波提取6 min;处理④（微波二次浸泡提取），先将处理好的原料在常温下浸泡2 h，再用250 W微波提取6 min，过滤提取液，等体积混合蒸馏水与残渣，微波提取6 min;处理⑤（微波冻融提取），将处理好的原料在-12 ℃下冷冻12 h，用250 W微波加热融化，重复2次，再按“处理③”的方法提取。

2 结果与分析

2.1 热水和微波提取的单因素试验结果

2.1.1 提取温度对提取率的影响。微波提取法中功率变化会引起热量的变化，因此其本质变量依旧是提取温度。由图1可知，提取率随着微波功率的增加而逐渐增大，当功率为250 W时，提取率最大，达8.90%，然后逐渐下降并趋于平缓。分析原因，起初功率增大带来的热能促进了细胞内容物的溶出，有助于提取，然而随着功率不断增大，过量的热能降解了多糖，致使提取率下降。 因此，250 W为最佳提取功率。由图2可知，热水提取法提取率在50 ℃时达到最高值，为3.90%，不到微波的1/2。这证明采用微波提取方法的高效性。

2.1.2 提取时间对提取率的影响。由图3可知，在一定范围内，提取率随提取时间的延长而呈现上升趋势，6 min时，达到最大值9.30%。随后，随着时间的进一步延长，曲线反而下降并趋于平缓。这可能与过度加热导致多糖降解与杂质溶出有关。在图4中，曲线趋势与图3大致相同，最大提取率出现在2 h点，所需时间为微波提取达到最大提取率的20倍，且热水提取法的最大提取率仅为4.40%。这再一次证明微波提取的优越性。

2.1.3 液料比对提取率的影响。由图5可知，液料比低于50∶1 时，随着液料比的不断增大，提取率呈现上升趋势，料液比为50∶1时，提取率达到峰值8.20%，此后缓缓下降。这可能是由于浓度差的增大加快了细胞内多糖的扩散速度，或是由于接触面积的增大，多糖溶出量增加，但是超过一定范围后，细胞内的物质已全部溶出，同时杂质也阻碍着多糖溶出，因此呈现下降趋势。由图6可知，热水提取法提取率达到峰值的料液比为50∶1，提取率仅为4.65%，与微波提取法相差甚远。

2.2 微波辅助提取工艺的正交优化

当不考虑各要素间的相互影响时，综上可知，微波提取法的最佳条件为微波功率250 W，提取时间6 min，液料比50∶1;热水提取法的最佳条件为温度50 ℃，提取时间2 h，液料比50∶1。

设计并建立正交试验（表2），通过方差分析确立对提取率产生最大影响的因素。试验结果表明：微波功率、提取时间和液料比是影响提取率的3个因素，其中最优方法是A2B2C3，即微波功率250 W、提取时间6 min、液料比为60∶1。方差分析表明：对于火麻仁多糖的提取，微波功率最为显著，其他2个因素略次之。

2.3 4种微波辅助提取法对提取率的影响

由表3可知，采用微波辅助提取法效率明显高于热水法，且处理④可明显提高提取率。在5种提取处理中，处理⑤最优，提取率高达11.11%。

3 讨论与结论

天然多糖是由生物体合成的一种生物大分子，其为生命活动提供了必需的支持与能量。在自然界中，天然多糖以不同的形式广泛存在于各类物质之中，如甲壳素、海藻酸、纤维素等均属于其范围之列[13]。作为生物体成长及蛋白质调节过程中的重要组成部分，天然多糖结构内存在着多种不同的官能基团，这些官能基团使其具有高的化学反应性，因而可以在疫苗、药物以及保健品等不同领域中得到应用[14-16]。火麻仁作为一种来源丰富且价格低廉的药材，拥有深远的药用历史，《神农本草经》记载，火麻仁可以弥补人体气血虚弱，润肠并刺激肠黏膜收缩，促进粪便排泄[17-18];到现代，火麻仁相关研究常见于火麻仁油和火麻仁蛋白方面[19-21]，而对于火麻仁多糖的研究较少。究其原因，可能与火麻仁多糖的提取率较低有关。

微波辅助提取过程中，高频微波能可使样品中的偶极分子产生偶极涡流、离子传导与高频率摩擦，这一过程中，大量热能被释放并参与到提取中[22-23]，裂解细胞壁，促进内容物溶出。多项研究表明，相比于传统提取法，微波提取法具有操作简单、提取率更高、不破坏多糖结构等多种优点[24-26]，因此被广泛用于真菌代谢物分离纯化[27]、多糖提取[28-29]、皂苷分离[30]以及挥发油纯化[31-32]等领域。该研究分别采用单因素和正交试验，研究了微波功率、提取时间、液料比3個因素对火麻仁多糖提取率的影响，确定微波辅助提取火麻仁的最佳条件，并与相同变量下热水提取法进行比较，发现微波辅助提取法优于热水提取法。然后，又比较了4种微波提取法（微波一次直接提取、微波一次浸泡提取、微波二次浸泡提取以及微波冻融提取）的提取率差异，进一步探明了4种提取法中微波冻融法效果最好，提取率高达11.11%。综上，该试验不仅为火麻仁多糖的提取及分离纯化提供了参考依据，还为火麻仁资源的开发及生物学活性探究提供了理论支持，同时为火麻仁多糖这一极具潜力的物质在食品、药品、洗化用品乃至保健品与饲料加工等方面的应用与扩展奠定了坚实的基础。

参考文献

[1]金贤兰.火麻仁的药理作用与临床应用[J].现代医药卫生，2007，23（17）：2624-2625.

[2]祝之友.火麻仁药材鉴别要点[J].中国中医药现代远程教育，2019，17（12）：144.

[3]贺海波，石孟琼.火麻仁的化学成分和药理活性研究进展[J].中国民族民间医药，2010，19（15）：56-57.

[4]LU R R，QIAN P，SUN Z，et al.Hempseed protein derived antioxidative peptides： Purification，identification and protection from hydrogen peroxide-induced apoptosis in PC12 cells[J].Food chemistry，2010，123（4）：1210-1218.

[5]DE JESUS RAPOSO M F，DE MORAIS R M S C，DE MORAIS A M M B.Bioactivity and applications of sulphated polysaccharides from marine microalgae[J].Marine drugs，2013，11（1）：233-252.

[6]WANG L C，WANG X Y，WU H，et al.Overview on biological activities and molecular characteristics of sulfated polysaccharides from marine green algae in recent years[J].Marine drugs，2014，12（9）：4984-5020.

[7]WANG Z J，XIE J H，KAN L J，et al.Sulfated polysaccharides from Cyclocarya paliurus reduce H2O2-induced oxidative stress in RAW264.7 cells[J].International journal of biological macromolecules，2015，80：410-417.

[8]牛庆川，李银莉，李玉萍.天然多糖羧甲基化对其生物活性影响的研究进展[J].天然产物研究与开发，2019，31（1）：170-174，183.

[9]REHM B H A.Synthetic biology towards the synthesis of custom-made polysaccharides.[J].Microbial biotechnology，2015，8（1）：19-20.

[10]LUO Y C，WANG Q.Recent development of chitosan-based polyelectrolyte complexes with natural polysaccharides for drug delivery[J].International journal of biological macromolecules，2014，64（1）：353-367.

[11]MANIVASAGAN P，OH J.Marine polysaccharide-based nanomaterials as a novel source of nanobiotechnological applications[J].International journal of biological macromolecules，2016，82：315-327.

[12]薛然.火麻仁多糖对环磷酰胺致小鼠肠道黏膜损伤的保护作用研究[D].舟山：浙江海洋大学，2019：35-48.

[13]GARCIA-VALDEZ O，CHAMPAGNE P，CUNNINGHAM M F.Graft modification of natural polysaccharides via reversible deactivation radical polymerization[J].Progress in polymer science，2018，76：151-173.

[14]USMAN A，KHALID S，USMAN A，et al.Algal polysaccharides，novel application，and outlook[M]//ZIA K M，ZUBER M，ALI M.Algae based polymers，blends，and composites.Amsterdam：Elsevier，2017：115-153.

[15]秦晓波.天然多糖类活性物质抗乙肝病毒的研究进展[J].世界最新医学信息文摘，2017，17（20）：25-26.

[16]廖美紅，石锐，张立群.天然多糖类纳米凝胶药物载体的研究进展[J].高分子通报，2016（12）：1-9.

[17]朱明群.麻子仁丸加减治疗便秘型肠易激综合征疗效观察[J].大家健康（学术版），2016，10（12）：38-39.

[18]秦川，陈纪东.中药火麻仁的研究进展[J].世界临床医学，2016，10（8）：173-174.

[19]周永红.火麻仁油中脂肪酸的GC-MS分析[J].中国油脂，2004，29（1）：72-73.

[20]扈学俸，李永进，王军波，等.火麻仁油安全性评价及血清抗氧化功能初步研究[J].中国食品卫生杂志，2008，20（5）：388-392.

[21]李永进，杨睿悦，扈学俸，等.火麻仁蛋白对小鼠抗疲劳和免疫调节功能的初步研究[J].卫生研究，2008，37（2）：175-178.

[22]黄秀英，蔡丽华.微波技术在现代中药房中的应用[J].哈尔滨医药，2009，29（4）：52-53.

[23]陶婷婷，邱伟芬.微波辅助提取新鲜番茄中番茄红素的工艺优化[J].食品与发酵工业，2010，36（3）：172-178.

[24]王道武，张龙，李亚丰，等.微波辅助提取GC-MS分析莪术挥发油成分[J].分析化学，2008，36（10）：1454.

[25]CHEE K K，WONG M K，LEE H K.Microwave extraction of phthalate esters from marine sediment and soil[J].Chromatographia，1996，42（7/8）：378-384.

[26]黄鹤，刘有平，王鑫，等.响应曲面法优化伸筋草总生物碱的微波辅助提取工艺[J].中国实验方剂学杂志，2014，20（18）：34-37.

[27]YOUNG J C.Microwave-assisted extraction of the fungal metabolite ergosterol and total fatty acids[J].J Agric Food Chem，1995，43（11）：2904-2910.

[28]范会平，符锋，GIUSEPPE MAZZA，等.微波提取法对樱桃、猕猴桃和枸杞多糖特性的影响[J].农业工程学报，2009，25（10）：355-360.

[29]李加林，刘霞，刘胜.微波辅助提取当归多糖的工艺研究[J].安徽农业科学，2012，40（34）：16573-16574，16596.

[30]CHEN Y，XIE M Y，GONG X F.Microwave-assisted extraction used for the isolation of total triterpenoid saponins from Ganoderma atrum[J].Journal of food engineering，2007，81（1）：162-170.

[31]邹小兵，陶进转，夏之宁，等.微波提取对挥发油化学成分的影响[J].分析化学，2011，39（1）：142-145.

[32]鲁建江，王莉，陈宏伟，等.佩兰中挥发油的微波提取法[J].时珍国医国药，2001，12（9）：774.