lncRNA PTPRG-AS1通过调控PI3K/Akt信号通路对卵巢癌细胞增殖和凋亡的影响

张 靖，冯晓杰，白惠娟

郑州大学附属肿瘤医院(河南省肿瘤医院)妇瘤科 郑州 450008

卵巢癌是致命的妇科恶性肿瘤之一[1]。目前，卵巢癌治疗主要采用手术联合辅助化疗等方法，但由于手术局限性、化疗耐药性以及肿瘤复发转移，晚期卵巢癌患者5 a生存率仍低于30%[2]。因此，了解卵巢癌的发病机制和分子改变对改善卵巢癌患者生存现状具有重要意义。研究[3]表明长链非编码RNA(lncRNA)在细胞增殖和凋亡调控等方面发挥着重要作用。lncRNA的表达异常与卵巢癌的进展有关。lncRNA生长抑制特异性转录本5(GAS5)在卵巢癌中表达下调，GAS5表达降低可促进细胞增殖、迁移和侵袭，提示卵巢癌预后不良[4]；lncRNA 性别决定区相关高迁移率族蛋白4(SOX4)在上皮性卵巢癌组织中表达上调，SOX4表达水平升高与肿瘤体积、肿瘤分级、转移距离呈正相关[5]；lncRNA HOX基因的反义基因间RNA(HOTAIR)在卵巢癌中表达上调，敲除HOTAIR基因可抑制顺铂诱导的自噬，从而提高卵巢癌对顺铂的敏感性[6]。有研究[7]通过基因芯片筛选卵巢癌中差异表达的lncRNA发现，蛋白酪氨酸磷酸酶受体G基因反义链1(PTPRG-AS1)在卵巢癌细胞中表达上调。PTPRG-AS1是PTPRG的反义lncRNA，PTPRG可通过抑制PI3K/Akt信号通路抑制鼻咽癌的生长和侵袭[8]。本研究旨在探讨PTPRG-AS1调控PI3K/AKT信号通路对卵巢癌细胞的增殖和凋亡的影响。

1 材料与方法

1.1细胞与主要试剂人正常卵巢上皮细胞HOSE，卵巢癌细胞株SKOV3、A2780、OVCR3购于中科院上海细胞库；si-con、si-PTPRG-AS1以及PCR引物由上海吉玛制药技术有限公司提供；PrimeScript one step RT-PCR试剂盒和SYBR Green PCR试剂盒购于大连TaKaRa生物技术有限公司；RIPA裂解液、MTT试剂盒、PVDF膜、Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒购于上海碧云天生物技术有限公司；RPMI 1640和opti-MEM培养基、胎牛血清为美国Gibco公司产品；兔源Cyclin D1、Bcl-2和Bax抗体为美国Abcam公司产品；鼠源Akt、p-Akt、PI3K、p-PI3K抗体为美国Santa Cruz产品；Trizol试剂、LipofectamineTM2000、辣根过氧化物酶标记的羊抗兔、羊抗鼠二抗为Invitrogen公司产品；胰岛素生长因子-1(IGF-1)为美国Sigma公司产品。

1.2组织来源选择2016年5月至2017年8月于我院确诊并进行手术切除的41例卵巢癌患者的癌组织和配对癌旁正常卵巢组织。将卵巢癌和正常卵巢组织标本分成小块，用不含RNA酶的磷酸盐缓冲液洗涤后置于液氮中保存。患者均签订知情同意书，术前均未接受过化疗或放疗。本研究经我院伦理机构审查委员会批准。

1.3细胞培养、转染和分组采用RPMI 1640培养基培养HOSE、SKOV3、A2780和OVCR3细胞，培养液中添加体积分数10%胎牛血清和100 U/mL链霉素/青霉素，培养条件为37 ℃、体积分数5% CO2、饱和湿度。细胞转染：将对数期SKOV3接种于6孔板，待细胞约50%～60%汇合时，采用无血清培养基同步化12 h。取适量si-con或si-PTPRG-AS1加入Opti-MEM培养基中室温孵育5 min，同时加入LipofectamineTM2000。然后将含有si-con或si-PTPRG-AS1的混合物分别加入SKOV3细胞中，依次标记为si-con组、si-PTPRG-AS1组，6 h后，更换含体积分数10%胎牛血清的RPMI 1640培养基，转染48 h后，检测转染效果。转染si-PTPRG-AS1 48 h后，用PI3K/AKT信号通路激活剂IGF-1处理细胞12 h，标记为si-PTPRG-AS1+IGF-1组。

1.4qRT-PCR检测细胞中PTPRG-AS1mRNA的表达分别提取HOSE、SKOV3、A2780和OVCR3细胞总RNA，利用Prime Script one step RT-PCR试剂盒将RNA反转为cDNA，采用SYBR Green PCR试剂盒利用Bio-Rad系统进行PCR扩增。引物序列：PTPRG-AS1上游为5’-GGGTAAGCGATC TACGCCC-3’，下游为5’-GTGGTTGCCCTCCTTAG GTC-3’；β-actin上游为5’-AAAGACCTGTACGC CAACAC-3’，下游为5’-GTCATACTCCTGCTTGCT GAT-3’。20 μL反应体系: 10 μL 2×SYBR Green Taq 6 μL的H2O，上、下游引物 各1 μL、2 μL cDNA。反应条件：94 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，共35个循环；72 ℃ 5 min。2-ΔΔCt法计算mRNA表达水平。实验重复3次。

1.5MTT法检测细胞增殖情况将各转染组SKOV3细胞按照1×103个/孔接种于96孔板，每组设3个复孔，贴壁后加入20 μL MTT，再培养4 h后弃去上清，每孔加150 μL的DMSO，继续孵育2 h至结晶溶解，利用酶标仪检测490 nm波长处吸光度(A)值。实验重复3次。

1.6细胞凋亡检测将SKOV3细胞按照1×106个/孔接种于6孔板，按照1.3方法进行转染，48 h后，用胰蛋白酶消化细胞，用预冷的PBS液洗涤细胞2次，2 000 r/min离心5 min。收集细胞，用1×结合缓冲液重悬，取100 μL细胞悬液(约含1×105个细胞)，随后分别加入5 μL Annexin V-FITC和PI，混匀避光孵育10 min，补足至500 μL，混匀后上流式细胞仪检测。实验重复3次。

1.7Western blot检测Cyclin D1、PTPRG、PI3K、Bcl-2、p-Akt、p-PI3K蛋白RIPA裂解液提取细胞总蛋白。取40 μg蛋白样品进行SDS-PAGE电泳，并转移至PVDF膜，50 g/L脱脂牛奶中封闭1 h，4 ℃条件下与一抗(Cyclin D1、PTPRG、PI3K按照1∶1 000稀释，Bax、Akt按照1∶1 500稀释，Bcl-2按照1∶2 000稀释，p-Akt按照1∶800稀释，p-PI3K按照1∶500稀释)孵育过夜，PBS冲洗3次，加二抗室温孵育2 h。利用ECL发光显色，Image J分析各条带灰度值，β-actin为内参。以目的蛋白和内参条带灰度值的比值表示目的蛋白的表达水平。实验重复3次。

1.8统计学处理采用SPSS 20.0分析，2种卵巢组织中PTPRG-AS1 mRNA表达的比较采用配对t检验，si-con和si-PTPRG-AS1组、si-PTPRG-AS1和si-PTPRG-AS1+IGF-1组SKOV3细胞各指标的比较采用两独立样本t检验；4种卵巢细胞间各指标的比较采用单因素方差分析和SNK-q检验，检验水准α=0.05。

2 结果

2.12种卵巢组织中PTPRG-AS1mRNA的表达卵巢癌组织中PTPRG-AS1表达量(3.21±0.22)较配对癌旁正常卵巢组织(1.00±0.09)增加(t=62.056，P<0.001)。

2.24种卵巢细胞中PTPRG-AS1mRNA的表达卵巢癌细胞株(SKOV3、A2780、OVCR3)中PTPRG-AS1表达水平较正常卵巢上皮细胞HOSE升高(P<0.05)，见表1。

表1 4种卵巢细胞中PTPRG-AS1 mRNA的表达

2.32组SKOV3细胞增殖和凋亡比较si-PTPRG-AS1组SKOV3细胞PTPRG-AS1的表达水平较si-con组降低，提示抑制PTPRG-AS1表达的卵巢癌细胞株构建成功。与si-con组比较，si-PTPRG-AS1组SKOV3细胞Cyclin D1和Bcl-2蛋白表达、细胞活力降低，Bax蛋白表达、细胞凋亡率升高，见图1和表2、3。

图1 2组SKOV3细胞增殖和凋亡相关蛋白的表达

表2 2组SKOV3细胞PTPRG-AS1 mRNA、增殖和凋亡的比较(n=3)

表3 抑制PTPRG-AS1的表达对SKOV3细胞增殖和凋亡相关蛋白表达的比较(n=3)

2.42组SKOV3细胞PTPRG及PI3K/Akt信号通路相关蛋白的表达与si-con组比较，si-PTPRG-AS1组SKOV3细胞PTPRG蛋白表达升高，p-Akt、p-PI3K蛋白表达降低，见图2和表4，提示抑制PTPRG-AS1表达可上调SKOV3细胞PTPRG蛋白的表达，抑制PI3K/Akt信号通路活化。

2.5激活PI3K/Akt信号通路对SKOV3细胞增殖和凋亡的影响与si-PTPRG-AS1组比较，si-PTPRG-AS1+IGF-1组SKOV3细胞Cyclin D1和Bcl-2蛋白表达、细胞A值升高，Bax蛋白表达、细胞凋亡率降低，见图3和表5、6。以上结果表明，激活PI3K/Akt信号通路能够逆转抑制PTPRG-AS1表达对SKOV3细胞增殖和凋亡的影响。

图2 2组SKOV3细胞PTPRG及PI3K/Akt信号通路相关蛋白的表达

表4 2组SKOV3细胞PTPRG及PI3K/Akt信号通路相关蛋白的表达( n=3)

图3 激活PI3K/Akt信号通路逆转PTPRG-AS1 siRNA对SKOV3细胞增殖和凋亡相关蛋白表达的影响

表5 激活PI3K/Akt信号通路对SKOV3细胞增殖和凋亡的影响(n=3)

3 讨论

据统计，每年全球有20多万妇女被诊断出卵巢癌[9]。因此，了解卵巢癌发生发展的分子机制，寻找新的有效治疗方法对卵巢癌患者的精准治疗意义重大。

lncRNA在转录和翻译中起着重要的作用。PTPRG-AS1是近年来发现的新型lncRNA，PTPRG-AS1在乳腺癌组织中表达上调，与患者的预后和治疗有关[10]；在胶质瘤细胞中，PTPRG-AS1通过靶向miR-185-5p调控胶质瘤细胞的生长[11]；在鼻咽癌中，PTPRG-AS1通过miR-194-3p分子海绵作用上调细胞质分裂调控蛋白1(PRC1)表达进而调控鼻咽癌细胞的放射敏感性和转移[12]。然而，PTPRG-AS1在卵巢癌中的作用并未完全阐明。本研究结果显示，与正常卵巢上皮细胞比较，3株卵巢癌细胞中PTPRG-AS1 mRNA的表达升高，与前人研究[7]相吻合。本研究结果亦表明抑制PTPRG-AS1表达后，SKOV3细胞增殖降低，细胞凋亡率增加促增殖蛋白Cyclin D1、抗凋亡蛋白Bcl-2表达降低，促凋亡蛋白Bax表达升高，提示PTPRG-AS1可作为卵巢癌治疗的新型分子靶点。

PI3K/Akt途径是许多信号分子下游信号传导通路，其激活参与调控细胞增殖、侵袭和转移和凋亡，与肿瘤的发生发展密切相关。近年来，大量研究表明，PI3K/Akt信号通路在卵巢癌中表现活跃，进而导致癌细胞的增殖和凋亡异常。Jin等[13]发现，lncRNA转移相关肺腺癌转录本1(MALAT1)通过激活PI3K/AKT通路促进上皮性卵巢癌的增殖和转移；王莉等[14]发现，利用siRNA干扰技术沉默高尔基体磷蛋白3(GOLPH3)可抑制PI3K/Akt信号通路进而抑制卵巢癌细胞的增殖，促进其凋亡。阻断PI3K/Akt信号通路是遏制卵巢癌进展的关键策略[15]。反义链RNA是研究最广泛的一类lncRNA，其通过与正义链的mRNA相互作用调控基因沉默、转录及mRNA的稳定性[16-17]。有研究[8]显示，PTPRG通过调控PI3K/Akt信号通路参与对鼻咽癌细胞生长和侵袭的调控。PTPRG-AS1是PTPRG的反义链lncRNA，卵巢癌细胞系中PI3K/Akt通路异常[15]。本研究采用RNA干扰技术抑制PTPRG-AS1在SKOV3细胞表达后，p-Akt的表达水平下降，而PTPRG蛋白的表达升高；进一步研究发现，激活PI3K/AKT信号通路可逆转抑制PTPRG-AS1表达对卵巢癌细胞的增殖和凋亡的影响。以上结果提示抑制PTPRG-AS1表达通过抑制PI3K/AKT途径活化进而降低卵巢癌细胞增殖能力，促进细胞凋亡，其机制可能与调控PTPRG表达有关。但其具体调控机制还有待进一步深入研究。

综上所述，lncRNA PTPRG-AS1在卵巢癌中表达上调，抑制lncRNA PTPRG-AS1表达可通过抑制PI3K/AKT途径降低卵巢癌细胞增殖能力，并促进细胞凋亡。PTPRG-AS1有望成为一种新的卵巢癌治疗分子靶点。