热敏灸抗凋亡减轻脑缺血再灌注损伤

黄丹丹，黄昌燕，张文平

（1.赣南医学院基础医学院病原生物学教研室；2.赣州市立医院检验科，江西 赣州 341000）

热敏悬灸对脑卒中患者的康复治疗作用显著［1-4］。热敏悬灸与传统悬灸在治疗时间和程序上有着本质的区别，通过适当延长悬灸的持续时间，并选择合适的体表热敏点，被施灸者可出现透热、扩热、传热等明显的热感传现象，此时的疗效也会明显提高［5］。热感传现象是热敏灸的重要标志，它的出现与否是决定灸疗效果的关键因素。在我们前期研究工作中观察到悬灸卒中大鼠大椎穴诱发的尾部温度升高与悬灸疗效密切相关，这与临床上热敏现象与疗效密切相关是一致的，并证实了尾温升高（平均升高3°C）是热感传现象在受灸大鼠上的体现［6］。

众所周知，在急性脑梗死的病理生理发展过程中，缺血半暗带区神经细胞发生凋亡的程度是影响脑梗死预后的重要因素之一［7］，寻找有效治疗方案抑制脑梗死后神经细胞的凋亡是国内外脑保护治疗的研究热点。鉴于热敏悬灸对脑梗死的显著疗效，本文将从抗神经细胞凋亡的角度，在脑缺血再灌注损伤大鼠热敏模型的基础上研究热敏悬灸对缺血性脑损伤的作用机理。

1 材料和方法

1.1 实验材料成年SD雄性大鼠（体重220～250 g）［购于上海斯莱克实验动物有限责任公司（动物许可证号SCXK2012-0002，SPF 级，动物质量合格证号0245636）］、3%的戊巴比妥钠、4-0 号丝线、鱼线（Simago钓具公司）、艾条（专门用于动物实验，长12 cm，直径0.6 cm，艾条由江西中医学院附属医院制造）、电子数字温度计（产自中国上海医用仪表厂）、生理盐水、2%2，3，5-三苯 基四 唑 氯 化 物（2，3，5-triphenyltetrazolium chloride，TTC）染液、4%多聚甲醛、10%、20%、30%蔗糖、TUNEL 试剂盒（南京凯基生物科技发展有限公司）、Leica 2000 显微镜（德国Leica公司）。

1.2 实验方法

1.2.1 动物分组大鼠随机分为3组：假手术组20只、缺血对照组20 只及悬灸组40 只。根据悬灸处理后大鼠尾温的变化，悬灸组进一步分为2个亚组，即：非热敏灸组（7 d 内尾温升高≤1 ℃）和热敏灸组（7 d内尾温升高＞1 ℃）。

1.2.2 局灶性脑缺血再灌注模型制备3%的戊巴比妥钠以30 mg·kg-1给大鼠腹腔注射麻醉。从颈部正中切开，分离颈总动脉、颈内动脉和颈外动脉。用4-0 号丝线结扎颈外动脉远端，再用4-0 号丝线结扎颈总动脉近端，另一根丝线松散的扎在颈总动脉分叉处。用一根头部圆润，直径0.205 mm、长5 cm的鱼线由颈总动脉插入，轻轻向前推进至大脑中动脉起始部（距离颈总动脉分叉处18 mm），而后，缠绕在颈总动脉上的丝线扎紧以阻止血流。经过2 h 栓塞后，鱼线从大脑中动脉的起始部抽出，使脑部血液再灌注。假手术组采用相同的操作手法，但不闭塞大脑中动脉。如术后24 h 内死亡、神经功能缺损评分为0分以及脑组织离体评估为蛛网膜下腔出血的大鼠不计入最终的统计分析。

1.2.3 悬灸治疗悬灸时室内温度维持在（25±2）℃。选取对脑功能有重要影响的大椎穴为受试穴［8］，将大鼠大椎穴处皮肤去毛，在距离皮肤约3 cm处用艾条每天悬灸1 次，每次悬灸40 min，共7 d，首次悬灸于大鼠缺血再灌注后6 h进行。

1.2.4 尾温测量用电子数字温度计精确测量悬灸组大鼠尾部中点的温度。静息时1次，开始灸后，每隔2 min 测1 次，灸40 min，共测量21 次。测量环境保持安静，室温维持在（25±2）℃。实验开始前需将大鼠放置于笼中30 min。

1.2.5 神经功能缺损评分由实验成员以外的测试者应用大鼠改良神经功能缺损评分量表（mNSS）［9］，分别在大脑中动脉栓塞再灌注后0 h、24 h、72 h 和7 d 进行神经功能缺损评估。该评分为18 分制，正常为0分，最高功能缺损为18分。

1.2.6 梗死体积的评估为观察热敏灸干预措施对大鼠大脑中动脉梗死后脑梗死体积变化的影响，将缺血再灌注72 h 后的大鼠用3%的戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，断颈处死后在冰上直接取脑并于－20 ℃冷冻20 min，随后将大鼠大脑置入专用的脑槽，在冰上进行大脑冠状切片，每片厚2 mm，随即将脑片浸入2%TTC 染液中，在37 ℃下避光孵育30 min，再用4%多聚甲醛固定12 h，红色为正常脑组织，白色为梗死脑组织。用IPP 6.0 计算机图像分析系统对图片进行分析，脑梗死体积的计算方法如前所述［10］。

1.2.7 TUNEL检测在大鼠脑缺血2 h再灌注24 h、72 h 两个时间点，用3%的戊巴比妥钠深度麻醉动物后，经左心室插管至升主动脉，并剪开右心耳，用生理盐水250 mL 快速冲洗，随后用4%多聚甲醛液先快后慢灌注约250 mL，断头取脑后置于4%多聚甲醛中固定24～28 h，最后分别用10%、20%、30%的蔗糖脱水过夜。采用冰冻切片法制成厚20 μm的冠状脑片。细胞凋亡检测严格按TUNEL 试剂盒说明书进行操作。光镜下神经元胞核中有棕黄色颗粒的为阳性，用IPP 6.0 软件，对每张切片大脑皮质缺血灶周围区TUNEL 阳性细胞的表达进行光密度值检测，用光密度/面积（IOD/area）表示。

1.3 统计学方法使用SPSS 20.0 软件进行数据分析，数据以平均值±标准差表示，应用单向方差法分析数据。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 纳入实验大鼠及其尾温变化特征20 只假手术组大鼠无一死亡；缺血对照组中有2 只因不符合标准被剔除；悬灸组中有3只因不符合标准被剔除；最终共计75只大鼠纳入统计。悬灸开始后，大鼠尾温开始升高，于5～10 min时，18只大鼠尾温升高到稳定水平，升高幅度平均值≤1 ℃，归类为非热敏灸组；19 只大鼠尾温继续升高，于20 min 时达到稳定水平，温度升高幅度平均值＞1 ℃（平均为3℃），归类为热敏灸组（见图1）。

2.2 神经功能缺损评分为检测悬灸40 min 治疗脑缺血再灌注损伤大鼠的疗效，我们于再灌注后0 h、72 h 和7 d 对大鼠进行神经功能缺损评分。结果表明，假手术组评分为0 分；0 h 三组评分比较差异无统计学意义（P＞0.05);72 h评分结果显示，与缺血对照组相比，非热敏灸组、热敏灸组神经功能缺损评分逐渐降低，热敏灸组与缺血对照组相比，差异有统计学意义（P＜0.05）；第7 d 评分结果显示，与缺血对照组相比，非热敏灸组、热敏灸组神经功能缺损评分均降低，差异均有统计学意义（P＜0.05），与非热敏灸组相比，热敏灸组神经功能缺损评分降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。见图2。

图1 艾灸大鼠尾温变化特征

图2 大鼠神经功能缺损评分

2.3 脑梗死体积的比较TTC 染色法检测脑缺血再灌注损伤大鼠72 h 的脑梗死体积，结果显示：热敏灸组大鼠脑梗死体积百分比明显低于非热敏灸组（P＜0.05）；与缺血对照组相比，热敏灸组大鼠脑梗死体积百分比降低（P＜0.01）；而非热敏灸组与缺血对照组比较，虽然梗死体积有所减少，但差异无统计学意义（P＞0.05)。见图3。

2.4 TUNEL 检测结果于脑缺血再灌注后24 h和72 h 分别进行TUNEL 检测。TUNEL 阳性染色为细胞核呈棕黄色颗粒，主要见于缺血灶周围区域。72 h较24 h的阳性染色有轻度降低。缺血再灌注后24 h，热敏灸组与缺血对照组或非热敏灸组比较，热敏灸组光密度值均明显降低（P 均＜0.05），而非热敏灸组与缺血对照组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；缺血再灌注后72 h，非热敏灸组与缺血对照组比较，非热敏灸组光密度值明显降低（P＜0.05），而热敏灸组与缺血对照组或非热敏灸组比较，热敏灸组光密度值明显降低（分别为P＜0.01、P＜0.05）。见图4。

图3 缺血再灌注72 h后各组脑组织TTC染色评估脑梗死体积比较

图4 TUNEL检测神经细胞调亡

3 讨 论

热敏灸是一项继承于传统艾灸，但在灸位、灸量和灸时上都有创新的现代灸疗技术，因其发现灸疗热敏新规律，从而显著提高了临床灸疗疗效［11］。热敏灸的核心思想是：“辨敏施灸，消敏定量，敏消量足”，它以舒适、高效、无毒副作用等优势，广泛应用于临床各科室，尤其在难治性病症上，收到了许多意想不到的效果［12-14］，脑梗死就是其中之一。

目前，许多研究表明脑缺血再灌注损伤的作用机理与细胞凋亡存在着密切的联系［15-17］。研究热敏灸治疗脑梗死对神经细胞凋亡的影响，有助于揭示热敏灸治疗脑梗死的机理。此外，热敏灸技术的重要特征之一是在悬灸热敏腧穴时，出现以下一种或几种艾灸热敏现象［18］：①透热，即灸热从施灸处表面透向深部组织甚至五脏六腑；②扩热，即灸热由灸点向四周扩散；③传热，即灸热由灸点沿着某一条线路向远处甚至病所传导；④局部不热或微热而远部热，即灸点不热或微热，但离灸点远处热；⑤表面不热或微热而深部热，即灸点表面不热或有微热，但灸点皮下深部组织等有热感；⑥产生其他非热的感觉，即灸点或远离灸点处产生麻、酸、胀、痛等不是热觉的奇异灸感现象。伴随这些热敏现象的出现，灸感传导之处，病症缓解。可见，热敏现象的出现是界定热敏灸与普通艾灸的关键所在。张毫、XIAO A J 等［19-20］曾通过热敏灸对脑缺血再灌注损伤模型大鼠的脑皮质神经细胞凋亡进行过研究，然而这些研究仅从灸疗时间上将普通艾灸组和热敏灸组进行简单区分，并未提及受灸大鼠是否出现热感传现象，也未设定热敏判定标准，对实验动物的分组缺乏科学性，对神经细胞凋亡的研究结果有失严谨。

在我们前期的研究工作中发现艾灸脑缺血再灌注损伤模型大鼠时，部分大鼠尾部出现温度明显升高的现象（平均升高3 ℃），且该升高的反应无法用艾热辐射解释，最后证明该现象为艾灸热敏现象在脑缺血再灌注损伤模型大鼠上的体现［6，21］。基于上述热敏模型的研究结果，本实验对热敏灸干预脑缺血再灌注损伤模型大鼠的神经细胞凋亡进行研究，以期解释其治疗机理。

传统悬灸的时间每次一般为10～15 min，或者以局部皮肤潮红为度，往往达不到治疗个体化的最佳灸量；而热敏灸通常需要较长时间，一般为30～60 min，故本研究选取40 min 作为治疗时间。在悬灸大鼠时，有18 只大鼠尾温平均升高≤1 ℃，这种程度的升高与艾热辐射有关，而其他19只大鼠尾温平均升高＞1 ℃，平均约3 ℃，且非艾热辐射所致，为热敏现象的体现。热敏灸理论指出［10］，不同个体即使患同一种疾病，所出现的热敏穴位也会有所不同。或许这18 只大鼠的热敏穴位不在大椎穴上，因此悬灸固定的大椎穴，一定会有部分大鼠没有热敏反应。

在检测细胞凋亡时，我们发现脑缺血再灌注后第3 天较第1 天阳性染色有轻度降低，这与其他研究结果出现的一般规律相似［22］。从行为学评分和TUNEL 染色结果分析，非热敏灸组即代表普通艾灸，对脑缺血再灌注损伤大鼠在抑制神经细胞凋亡、改善行为学方面虽然有一定作用，但与热敏灸比较，仍存在很大的差距。从脑梗死体积检测中我们可以看到，伴随热敏现象的脑缺血再灌注大鼠，梗死体积明显减少，这都有助于尽可能保留正常组织、减轻神经细胞凋亡、降低神经功能缺损评分。

本研究建立在脑缺血再灌注损伤大鼠热敏模型的基础上，从抗细胞凋亡角度揭示了热敏灸高效治疗中风的机制。当然，影响脑梗死预后的因素除了细胞凋亡，还涉及诸如兴奋性毒性、炎症、血管通透性、氧化应激等病理生理过程，进一步对相关机制进行研究有助于更加全面认识热敏灸治疗缺血性卒中的作用机理。