肉鸡对日粮中添加竹叶提取物的耐受性研究

沈明明，季书立，闫恩法，韩红丽，贠阳，张婧菲，王恬，张莉莉

(南京农业大学动物科技学院，江苏 南京 210095)

竹叶在我国具有悠久的食用与药用历史，而利用竹叶制作的一些产品也进入人类生活，如竹叶茶、竹叶啤酒、竹康宁胶囊等[1]。竹叶成分复杂，但随着技术的进步，研究人员已经利用竹叶开发出以黄酮、多酚和多糖为主要活性成分的功能性物质，即竹叶提取物(bamboo leaf extract，BLE)。研究发现，BLE具有优良的防腐抑菌抗氧化功效[2-3]，目前在食品工业中已得到广泛应用。据报道，肉产品制作过程中添加BLE可减缓衰败延长保质期，在食用油加工、膨化食品和酒水饮料中加入BLE也可有效提高产品品质[4]。近些年，有少量工作者将BLE应用于畜牧生产中，研究发现在罗氏沼虾和中华绒螯蟹中添加BLE可提高产品的抗氧化能力；奶牛全混合日粮中添加BLE可提高其产奶量和奶品质[5]；肉鸡日粮中添加BLE可提高胸肌肉系水力、pH值和嫩度[6]，并且提高机体抗氧化能力[7]。而饲料添加剂的安全关乎人类健康，无论直接添加或者间接添加到动物饲料中都必须有一个安全严格的范围。因此，本试验以肉仔鸡为模型，基于前期试验工作筛选的一个安全有效剂量(0.30%)，以5倍、10倍高剂量添加到肉鸡饲料中，通过研究高剂量竹叶提取物(1.50%和3.00%)对肉鸡生长性能、器官指数、血常规、血清生化指标和组织病理学的影响，对BLE在肉鸡上耐受剂量进行评价，为BLE作为肉鸡饲料添加剂在畜牧生产中的应用提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

爱拔益佳(AA)肉鸡由安徽和威农牧集团提供；竹叶提取物由浙江新篁生物科技有限公司提供，有效成分：总黄酮含量70 mg/g，总多酚含量50.42 mg/g；VITALAB Selecta E 全自动生化分析仪，荷兰 MERK 公司。

总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、天冬氨酸转氨酶(AST)、丙氨酸转氨酶(ALT)、总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)，血糖(GLU)、尿素氮(BUN)、总胆红素(TBIL)、肌酐(CRE)试剂盒，上海科华生物工程有限公司。

1.2 试验设计与日粮

试验设计采用随机单因子试验，选择体重相近、1日龄的AA肉鸡320只，随机分为4组，即对照组、有效剂量组、5倍剂量和10倍剂量组；每组8个重复，每个重复10只鸡。对照组饲喂基础日粮，试验组在每千克基础日粮中分别添加0.30%、1.50%和3.00% BLE。试验分为前期1～21 d和后期22～35 d，共计35 d。试验基础日粮配方参照NRC1994《家禽的营养需要量》，日粮组成及营养成分见表1。

表1 基础饲粮组成及营养水平

1.3 饲养管理

所有试验肉鸡饲养于同一鸡舍和同一饲养条件，试验前对鸡舍及器具进行消毒，通风散气1周后引进鸡苗，置于三层笼养。饮水槽和料槽每日清理1次，每日喂料2次。试验期间肉鸡自由采食与饮水，光照管理为23 h光照和1 h黑暗。肉鸡免疫接种与鸡舍消毒均按常规进行。

1.4 样品采集

试验第21和35 天每个重复选取1只肉鸡，翅静脉采血于EDTA抗凝采血管中用于测定血常规指标，随后颈静脉采血于10 mL非抗凝管中，4 ℃、3 500 r/min离心10 min制备血清，并置于-20 ℃冰箱保存。

1.5 指标测定

1.5.1 生长性能

1日龄试验鸡体重于进鸡当日按重复称重，于试验第21和35 天早晨称重(此前停饲12 h，自由饮水)，计算肉鸡平均重(ABW)。每天记录肉鸡的采食量，以重复为单位分别计算平均日采食量(ADFI)、平均日增重(ADG)和料重比(F/G)。

1.5.2 器官指数

试验第21和35 天每个重复选取1只肉鸡，颈静脉放血致死后迅速解剖，取心脏、肝脏、脾脏、胸腺和法氏囊。剔除器官脂肪并迅速称重，计算器官指数(器官重/肉鸡活重×100%)。第35天同时取心脏、肝脏、胰腺、胸腺等组织于4%多聚甲醛固定用于制作HE染色切片。

1.5.3 血常规指标

将采集的抗凝血送至武汉赛维尔生物科技有限公司，使用迈瑞兽用全自动血液细胞分析仪分析血液常规指标，主要包括白细胞数(WBC)、红细胞数(RBC)、血红蛋白浓度(HGB)、红细胞压积(HCT)、血小板数(PLT)和平均血小板体积(MPV)。

1.5.4 血清生化指标

取保存于-20 ℃的血清，4 ℃解融后利用全自动生化分析仪测定TC、TG、TP、ALB、GLU、BUN、TBIL、CRE含量和AST、ALT活力。

1.5.5 器官组织学观察

心脏、肝脏、胰腺、胸腺等组织经多聚甲醛固定后，经水洗、包埋、切片、染色后，进行组织病理学观察。

1.6 数据处理

数据分析采用完全随机化设计，以重复为试验单位。所有数据经 Excel 2016 进行初步处理，采用SPSS 20.0统计软件进行分析，采用单因素方差分析(One-way ANOVA)进行显著性检验，LSD进行多重比较，同时进行线性二次分析，以P<0.05为差异显著判断标准。

2 结果与分析

2.1 日粮添加不同剂量竹叶提取物对肉鸡生长性能的影响

试验结果表明(表2)，在试验前期，与对照组相比，添加高剂量BLE对肉鸡ADFI、ADG、F/G和21 d时ABW无显著影响(P>0.05)。试验后期，添加高剂量BLE则显著提高肉鸡ADFI和ADG，其中ADFI分别提高14.31%和14.49%；ADG分别提高11.80%和11.93%，且线性升高显著(P<0.05)；但添加高剂量BLE对F/G无显著影响(P>0.05)。以整个试验周期来看，添加BLE对肉鸡ADFI、ADG和F/G均无显著影响(P>0.05)。

表2 日粮添加不同剂量竹叶提取物对肉鸡生长性能的影响

2.2 日粮添加不同剂量竹叶提取物对肉鸡器官指数的影响

试验前期(表3)和后期(表4)，与对照组相比，添加BLE对肉鸡各器官指数无显著影响(P>0.05)，但试验前期肉鸡肝脏指数有线性升高的趋势(P<0.1)，前期和后期肉鸡胸腺指数有降低的趋势(P<0.1)。

表3 日粮添加不同剂量竹叶提取物对肉鸡前期器官指数的影响 %

表4 日粮添加不同剂量竹叶提取物对肉鸡后期器官指数的影响 %

2.3 日粮添加不同剂量竹叶提取物对肉鸡血常规指标的影响

由表5可知，试验前期，与对照组相比，添加不同剂量BLE对肉鸡WBC、RBC、HGB和HCT无显著影响，但高剂量组PLT显著降低，且线性降低显著(P<0.05)，BLE可显著提高肉鸡MPV，且线性升高显著(P<0.05)。

由表6可知，试验后期，与对照组相比，添加不同剂量BLE对肉鸡血常规指标无显著影响(P>0.05)。

表5 日粮添加不同剂量竹叶提取物对肉鸡前期血常规的影响

表6 日粮添加不同剂量竹叶提取物对肉鸡后期血常规的影响

2.4 日粮添加不同剂量竹叶提取物对肉鸡血清生化指标的影响

试验前期(表7)，与对照组相比，添加高剂量BLE可显著降低肉鸡血清TC含量，分别降低16.88%和16.24%，且线性和二次性降低显著(P<0.05)；0.30%和1.50%组肉鸡血清总TG水平显著低于对照组，分别降低46.00%和36.00%，且随着BLE添加剂量的提高，血清TG水平呈线性降低(P<0.05)。

试验前期0.30%和3.00%组肉鸡血清AST活力显著低于对照组，且随着BLE添加量的升高，血清AST活力前期(表7)呈线性显著降低和后期(表8)呈二次性降低(P<0.05)。与对照组相比，试验前期和后期0.30%和3.00%组肉鸡血清ALB含量显著升高，分别提高17.63%、18.37%和18.12%、19.39%。并且随着BLE添加量的升高，血清ALB线性升高显著(P<0.05)。试验前期1.50%组和后期1.50%、3.00%组肉鸡GLU含量显著高于对照组，且肉鸡前期血清GLU含量随BLE剂量呈显著二次性升高，后期呈线性升高(P<0.05)。

表7 日粮添加不同剂量竹叶提取物对肉鸡前期血清生化指标的影响

表8 日粮添加不同剂量竹叶提取物对肉鸡后期血清生化指标的影响

2.5 日粮添加不同剂量竹叶提取物对肉鸡器官组织病理学的影响

在对肉鸡进行解剖时发现肉鸡腹腔、胸腔结构完整，内部无积水或异物出现，心、肝、脾、胰腺、肾脏表面光滑，结构完整，大小适中。食管、腺胃、十二指肠和空肠等消化组织表面颜色正常，未见出血点和糜烂等情况。通过对照组和BLE剂量组的组织切片观察发现，添加BLE未对实质性组织造成病变(如心、肝和胰腺)。各组肉鸡心脏(图1)HE染色切片观察发现心肌着色均匀，心肌纤维结构完整清晰、排列规则整齐，隔膜清晰可辨，肌浆丰富饱满，内部未见明显异常，视野内未见炎性细胞浸润与结节病变。各组肝脏HE(图2)切片观察表明：肝脏结构清晰可辩，肝小叶结构正常，肝细胞排列呈索状，无坏死及变性，肝窦无扩张，汇管区无可见炎性细胞浸润，视野内未发现脂肪样变化，核细胞及细胞边界结构清晰。胰腺HE(图3)切片观察发现胰腺结构清晰，腺泡细胞分叶少，排列紧密，胰岛排列呈团索状，数量较多，形状规则，边界分明，胰岛内细胞数量多。

A. 对照组；B. 0.30%BLE组；C. 1.50%BLE组；D. 3.00%BLE组。下同

图2 肉鸡肝脏病理切片(比例尺=50 μm)

图3 肉鸡胰腺病理切片(比例尺=50 μm)

3 讨论

BLE是由竹叶黄酮、多酚和多糖组成的生物活性物质。据报道黄酮、多酚类物质具有类雌激素作用，可促进机体生长发育[8]；但有报道称机体摄入高剂量大豆黄酮会抑制睾酮和生长激素的合成与释放，反而抑制生长[9]。张锦玥等[10]报道竹叶黄酮可以缓解肉鸡免疫抑制导致的生长受限。

舒刚等[11]以7日龄肉鸡为模型，在饮水中加入1、3、5和10 g/L竹叶黄酮连续添加7 d，同样发现10 g/L剂量饮水添加未造成肉鸡生长受限，这与本试验结果类似，可见BLE并不会影响肉鸡生长。此外，Lu等[12-13]对小鼠90 d口服BLE溶液进行毒性的研究表明，小鼠采食量与日增重并没发生显著变化，其中最高剂量4.3 g/kg也未对小鼠产生毒害作用，可推断BLE毒性较小。整体而言，从表观上看肉鸡饲料最高添加3.00% BLE对机体生长发育不会造成影响，BLE具有一定的安全性。

大多数研究报道器官指数越高说明机体发育越好[14]，李正田等[15]报道日粮中添加适量竹叶黄酮可提高济宁百日鸡早期肝脏指数，这与本试验结果类似。丁红秀等[16]阐明BLE能够显著改善小鼠肝肿大、降低肝脏粗脂肪含量，而本试验后期BLE对肝脏指数无显著影响可能与降低脂肪含量有关。虽然胸腺指数有降低的趋势，但和对照组相比无显著差异，且组织病理学检查表明胸腺皮髓、皮质结构正常，胸腺小叶结构完整体积正常，因此认为该降低趋势与竹叶提取物添加量无关。从器官指数可见BLE未对肉鸡器官发育造成影响。

血常规指标对诊断机体健康具有重要临床意义。白细胞是体内重要的免疫细胞，通过分泌白介素、干扰素、肿瘤坏死因子等参与机体炎症与免疫调控[17]；当机体内环境稳态失衡时会导致红细胞增多或减少，而血小板是重要的凝血因子[18]。本试验中虽然BLE显著降低前期PLT，但可通过提高血小板的体积来弥补血小板数目的减少，从而维持肉鸡凝血功能。BLE对肉鸡后期血液常规指标也未造成影响，可见肉鸡代谢正常，并未产生毒害作用。

研究表明BLE可改善高脂血症小鼠脂质代谢，降低血清TC含量[16]；且BLE对糖尿病并发症小鼠也有改善糖脂代谢作用[19]。大量研究证实植物源性黄酮、多酚类物质在肉鸡机体发挥明显的降脂作用，如染料木黄酮[20]和大豆黄酮[21]。先前研究表明BLE可能通过上调胆固醇 7-α羟化酶 (CYP7A1)、低密度脂蛋白受体 (LDLR)和下调3-羟-3-甲基戊二酸单酰辅酶 A 还原酶 (HMGCR)基因的表达来降低血清TC含量[22]，而本试验结果说明即便BLE添加量很高的情况下仍然可以改善肉鸡脂质代谢，并且存在剂量效应。当肝脏受损时，血清中ALT和AST会显著升高。Zhang等[23]研究表明BLE可以缓解肝损伤，并且降低血清ALT和AST活力，这与本试验结果类似，机体从食物中吸收蛋白质进行合成ALB，肝脏是合成ALB的场所，当机体消化吸收功能出现障碍时，肝细胞则无法获取前体物质进行蛋白合成，从而血清ALB水平降低，并且ALB水平与免疫功能密切相关[24]。本试验中血清ALB变化与吴红燕等[25]研究结果相同，但蛋白含量升高可能也与竹叶黄酮减少体内蛋白质分解和糖原消耗有关。以上结果提示BLE未对肝脏合成ALB能力造成影响，可见添加BLE未引起肝脏损伤。Yang等[26]阐明黄酮类物质可与α淀粉酶活性部位发生作用，从而抑制葡萄糖生成。本试验中血糖变化与吴红燕等[25]研究结果不一致，推测可能是BLE富含竹叶多糖所致。TBIL是血液循环中衰老红细胞在肝脏、脾脏及骨髓的单核吞噬细胞系统中分解和破坏的产物；血清中CRE浓度可以衡量肾小球功能，而BUN则反映蛋白质和氨基酸之间的平衡状况[21]。本试验结果表明BLE对肉鸡血清TBIL、CRE和BUN含量无显著影响，可见肉鸡肝脏、肾脏等器官功能正常。器官组织的病变会影响血液指标的变化，而本试验结果表明肉鸡血液指标无异常，可见各器官结构完整、功能正常。舒刚等[11]同样发现肉鸡饮水中添加BLE也不会影响肉鸡器官组织结构，这与本试验结果类似。可见BLE的安全性不会因为添加方式的改变而发生变化。

4 结论

本试验结果表明，肉鸡日粮添加BLE可提高肉鸡后期ADFI和ADG，BLE对肉鸡器官指数无显著影响。血常规和血清生化指标表明BLE对肉鸡脂质代谢具有改善作用，且未对肉鸡内脏器官功能造成影响，病理切片显示BLE对肉鸡器官未造成损伤。综上所述，肉鸡对BLE具有一定的耐受性，BLE可作为一种安全肉鸡饲料添加剂使用。