非洲猪瘟病毒LAMP可视化快速检测方法的建立与应用

王林，吴迪，高晓龙，张玮，张启龙，栗云鹏，韦海涛，周德刚，刘晓冬，宋彦军

(北京市动物疫病预防控制中心，北京 102629)

非洲猪瘟(African swine fever，ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus，ASFV)引起的猪以呼吸障碍、神经症状和全身出血为主要特征的急性、热性、高度传染性疫病。家猪感染后的临床表现为高热、呕吐、腹泻或便秘，最明显的剖检症状为脾脏肿大，致死率可高达100%[1]。1921年在肯尼亚首次记载了非洲猪瘟的暴发，之后该病主要流行于非洲各国，并相继传入西欧、南美和东欧等多个国家，造成了重大的经济损失和社会危害[2]。具有诊断学意义的病毒基因主要有B646L，大小为1 938 bp，编码结构蛋白P72(VP73)，位于中心保守区[3]。在不同毒株间核苷酸同源性达95.5%～100%，氨基酸同源性达97.8%～100%[4]。B646L是公认的分子检测技术引物设计的理想靶标。2018年8月3日辽宁省沈阳市首次暴发非洲猪瘟疫情，10个月内席卷全国31省市，累计报告疫情152起，给我国养猪业造成重大经济损失[5]。目前尚无有效疫苗进行防控，因此在临床上需要一种能够快速检测或筛查ASFV毒株的检测方法。

环介导等温扩增(LAMP)方法是由日本学者Notomi在2000年发明的一种适用于基因诊断的恒温核酸扩增技术[6]，该方法利用设计的4条特异性引物和具有链置换特性的BstDNA聚合酶，在30～60 min内对目的片段进行扩增[7]，是一种简便、快速、精确、廉价的基因扩增方法[8]。LAMP方法适合现场、基层快速检测，本研究建立的基于钙黄绿素可视化LAMP检测ASFV的方法，经过一系列优化试验，对特异性、灵敏性、应用仪器设备与临床样品检测进行摸索，建立了一种ASFV LAMP目视法检测方法，以期应用于ASFV现场快速诊断。

1 材料与方法

1.1 样品及阳性质粒来源

ASF阳性样本(灭活)、猪细小病毒(PPV)核酸、猪圆环病毒2型(PCV2)核酸、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、ASF阴性样本核酸由北京市动物疫病预防控制中心保存。ASFV P72基因的重组质粒、pUC57空载体由赛默飞世尔科技有限公司合成。

1.2 主要试剂

脱氧核糖核酸扩增试剂盒(生产批号：94001)、荧光目视检测试剂盒(生产批号：94001)购自荣研生物科技(中国)有限公司。非洲猪瘟病毒荧光PCR检测试剂盒(生产批号：040221901)购自青岛立见诊断技术发展中心；反转录试剂盒(生产批号：6110A)购自宝日医生物技术(北京)有限公司；无核酸酶水购自北京全式金生物技术有限公司；猪瘟病毒(CSFV)活疫苗C株购自广东永顺生物制药股份有限公司；猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)R98株、猪伪狂犬病毒(PRV)Bartha-K61株购自瑞普(保定)生物药业有限公司。

1.3 引物设计与合成

根据GenBank已发表的非洲猪瘟病毒结构蛋白基因(登录号:MH910495.1)，通过对GenBank里的60条非洲猪瘟P72基因的序列比对分析，找出一段相对保守的基因序列，运用在线生物软件(http://primerexplorer.jp/)，通过调整溶解温度(Tm)值、鸟嘌呤(G)与胞嘧啶(C)所占比例、吉布斯自由能(dG)临界值和扩增长度等参数值，设计2组适用于LAMP的特异性外引物组(表1)，包括基础引物(F3、B3、FIP、BIP)和环引物(LB)。引物由赛默飞世尔科技(中国)有限公司合成。

表1 引物组序列

1.4 ASFV质粒合成与核酸提取

ASFV P72基因重组质粒pUC57-p72、pUC57空载体，由赛默飞世尔科技(中国)有限公司合成。对CSFV活疫苗C株、PRRSV(R98株)，PRVBartha-K61株利用全自动核酸提取仪进行核酸提取，通过反转录试剂盒将提取的CSFV活疫苗C株、PRRSV(R98株)核酸反转录为cDNA,-20 ℃保存备用。

1.5 阴、阳性对照的制备

合成ASFV P72基因重组质粒pUC57-p72，含目的片段336 bp，稀释到103copies/μL,即为阳性对照。将pUC57空载体质粒和无核酸酶水，按照1∶9的比例进行配制，混匀，终浓度为103copies/μL，即为阴性对照。

1.6 LAMP反应体系的建立与优化

为获得较为理想的反应体系，提高反应的灵敏性，分别对引物浓度和反应温度进行优化试验，筛选出最佳的引物浓度和反应温度。以ASFV质粒(10 ng/μL)为模板，引物浓度按照试剂盒推荐浓度进行优化，反应温度分别设置61、63、65和67 ℃ 4个温度进行筛选。

1.7 特异性试验

以提取的ASFV阳性样品核酸、PRV、CSFV、PRRSV、PPV、PCV2、PEDV、猪健康组织核酸为模板进行LAMP特异性检测，评价建立的可视化LAMP检测方法的特异性。

1.8 灵敏度试验

将合成的ASFV质粒经微量核酸蛋白检测仪测定，浓度为10 ng/μL，按公式：copies/μL= (6.02×1023copies/mol×10 ng/μL×10-9)/(DNA长度×660 g/mol) 计算ASFV质粒的拷贝数为3×105copies/μL，将质粒浓度稀释到103copies/μL，按1∶10倍比稀释，进行LAMP可视化检测方法的灵敏度研究。同时，采用ASFV荧光PCR检测试剂盒(青岛立见诊断技术发展中心)进行灵敏度检测比对，当被检样品循环数值(Ct值)<40且出现特异性扩增曲线，判为阳性；当无Ct值或Ct值≥40，判为阴性。

1.9 不同恒温设备对LAMP检测结果的影响

将浓度为102copies/μL的ASFV质粒，按1∶10倍比稀释，稀释到10-3copies/μL。分别在PCR仪器、恒温水浴锅2种不同设备进行LAMP可视化检测反应，设置反应条件均为63 ℃ 50 min，比较不同恒温设备对试验结果产生的影响。

1.10 阳性样品判读时间的确定

将ASFV质粒在103～10-2copies/μL梯度范围内进行10倍倍比稀释后作为模板进行LAMP检测，确定最低检测限浓度范围，将95%检出率模板浓度定为最低检出限，由此确定检测方法阳性结果判读时间。

1.11 临床样品检测

用已建立的可视化LAMP检测方法与ASFV荧光PCR检测试剂盒同时检测由本实验室保存的300份已知阴性和阳性的临床样品核酸(其中292份为阴性样品，8份为阳性样品)，比对2种检测方法的符合率。

2 结果

2.1 引物组合的筛选

对设计出的2组引物，利用ASFV阳性样品核酸为模板，进行LAMP浊度仪检测。引物组1在28 min检出ASFV阳性样本核酸，PPV、PCV2、PEDV、CSFV、PRRSV、PRV在120 min内均未检出(见图1)。引物组2在70 min检出ASFV阳性样本核酸，PPV、PCV2、PEDV、CSFV、PRRSV、PRV在120 min内均未检出(见图2)。分别使用ASFV质粒(10 ng/μL)与ASFV阳性样本核酸对引物组1进行扩增效果验证，浊度仪扩增曲线结果显示(见图3)，ASFV质粒与阳性样本核酸均在50 min内检出，阴性对照在120 min内未检出。结果表明，引物1组合具有较高的扩增效率和特异性。

1. ASFV阳性样品；2. PPV；3. PCV2；4. PEDV；5. CSFV；6. PRRSV；7. PRV

1. ASFV阳性样品；2. PPV；3. PCV2；4. PEDV；5.CSFV；6. PRRSV；7. PRV

1. ASFV病毒质粒；2. ASFV阳性样品；3. 阴性对照

2.2 LAMP反应体系的建立与优化

经过一系列LAMP反应条件的优化，得到最优反应体系为：2×反应缓冲液12.5 μL，8 μmol/L的外引物F3 1 μL，8 μmol/L的外引物B3 1 μL，35 μmol/L的内引物FIP 1 μL，35 μmol/L的内引物BIP 1 μL，15 μmol/L的环引物LB 1 μL，无DNA酶的蒸馏水0.5 μL，酶溶液1 μL，荧光目视检测试剂1 μL，模板5 μL。61、63、65和67 ℃出现扩增曲线的时间分别为30、24、27和28 min(见图4)，最佳反应温度为63 ℃。

A.61 ℃；B.63 ℃；C.65 ℃；D.67 ℃

2.3 灵敏度试验

将ASFV质粒进行10倍倍比稀释，浓度范围由103～10-2copies/μL。对本研究建立的LAMP可视化快速检测方法与非洲猪瘟病毒荧光PCR检测试剂盒进行灵敏度检测比对。结果显示，本研究建立的ASFV可视化LAMP检测方法与非洲猪瘟病毒荧光PCR检测试剂盒均可以检出到10 copies/μL。详见图5、图6。

2.4 特异性试验

采用建立好的LAMP可视化检测方法对ASFV、PRV、CSFV、PRRSV、PPV、PCV2、PEDV、猪健康组织核酸进行检测，结果显示，只有ASFV核酸的检测结果为阳性，其他均为阴性(见图7)。

1～6. 质粒稀释浓度为103 ～10-2 copies/μL；7～8. 阴性对照

1～6. 质粒稀释浓度为103 ～10-2 copies/μL；7. 阴性对照；8. 阳性对照

1：ASFV病毒；2：PRV；3：CSFV；4：PRRSV；5：PPV；6：PCV2；7：PEDV；8：猪健康组织

2.5 不同设备对LAMP检测结果的影响

将ASFV质粒(102～10-3copies/μL)分别在PCR仪器、恒温水浴2种设备进行LAMP可视化检测，设置反应温度63 ℃，反应时间50 min，结果显示，使用PCR仪器与恒温水浴设备可同时检测到10 copies/μL(见图8和图9)。

1～6. 质粒稀释浓度为102 ～10-3 copies/μL；7～8. 阴性对照

1～6. 质粒稀释浓度102～10-3 copies/μL；7～8. 阴性对照

2.6 阳性样品判读时间的确定

将ASFV质粒在103～10-2copies/μL梯度范围内进行10倍倍比稀释后作为模板进行LAMP检测，得出低于1 copies/μL无扩增曲线，高于102copies/μL检出率为100%，因此确定102～1 copies/μL为最低检测限浓度范围，将102、10 和1 copies/μL 3个浓度分别做20次重复检测，结果显示(表2)，102copies/μL模板检出率为100%，10 copies/μL模板检出率为95%，1 copies/μL模板检出率为50%。因此，确定最低检出限为10 copies/μL浓度，扩增曲线时间范围在40～48 min，设定检测样品在50 min内出现扩增曲线为阳性。

2.7 LAMP可视化临床检测试验

用已建立的LAMP可视化检测方法与ASFV荧光PCR检测试剂盒同时检测300份临床样品核酸(292份为阴性，8份为阳性)。比对2种检测方法的符合率，结果建立的LAMP方法与荧光定量PCR方法检测结果一致，符合率为100%。

表2 阳性样品判读时间的确定 min

3 讨论

目前，全世界尚无有效的非洲猪瘟疫苗进行预防。农业农村部要求猪场、屠宰场、饲料厂与跨省调运、流通环节必须进行非洲猪瘟病毒检测。ASFV诊断主要分为分子生物学检测与免疫学检测技术两类。由于免疫学检测技术特异性与敏感性较低，因此，分子诊断得到了迅速发展。分子诊断技术主要包括PCR、实时荧光定量PCR、LAMP检测技术[9]。LAMP检测技术针对靶基因设计的特殊引物与BstDNA聚合酶，可以在短时间内高效的扩增靶基因，并可通过荧光染色、电泳、钙黄绿素可视化等方法进行结果观察[10]。2011年杨吉飞等[11]建立了ASFV LAMP检测方法，在65 ℃水浴锅中进行反应，利用琼脂糖凝胶电泳进行结果判读，结果显示有严重拖尾现象，影响结果判读且极易增加气溶胶污染，气溶胶在微生物实验室中很难消除。为避免这一现象，本研究严格在生物安全二级实验室中进行操作，开启机械通风系统，在生物安全柜中进行反应体系的配置及模板的加入，通过在反应体系中加入钙黄绿素荧光染料，实现了LAMP反应管无需开盖便可读取试验结果，方便安全[12]。

与荧光定量PCR检测方法相比，LAMP检测方法更加快速简便，本研究建立的ASFV LAMP检测方法反应时间为50 min，快速荧光定量PCR检测时间约为65 min， LAMP检测方法比荧光定量PCR检测方法检测时间节省15 min，灵敏度与荧光定量PCR检测方法持平。任名等[13]通过对反应体系及条件的优化，建立了ASFV Taqman探针法荧光定量PCR检测方法，灵敏度可以达到10 copies/μL，反应时间约为1 h。同时，ASFV LAMP可视化检测方法可在恒温水浴设备、PCR仪器中进行操作，均可检出10 copies/μL病毒含量，并能同时检测多个样品。既可满足现场快速检测条件，也可在实验室利用PCR检测设备进行结果判定，具有很强的实用性与便捷性。

综上，本研究建立的ASFV LAMP检测方法具有速度快、灵敏度高、不受实验室仪器设备限制、结果可视化等优点，适用于临床非洲猪瘟病毒的现场快速检测。