毛竹水溶性多糖提取工艺的优化及结构表征

王 瓅，王素雅，周芹芹，张万佳

（1. 南京财经大学 食品科学与工程学院，江苏 南京 210023；2. 江苏省现代粮食流通与安全协同创新中心，江苏 南京 210023；3. 江苏高校粮油质量安全控制及深加工重点实验室，江苏 南京 210023）

中国栽培及食用竹笋的历史十分悠久，已有千年。竹笋味甘、微寒，具有消渴、清肺及化痰的效用，有“寒土山珍”之称[1]。此外，竹笋还具有较高的营养价值，含有丰富的多糖、黄酮、生物碱及钙、铁、硒、磷等多种微量元素成分，具有消炎、防癌、抗衰老、降血压等[2]作用。

毛竹（Phyllostachys pubescensy）属于禾本科竹亚科，是一种多功能林业植物，具有强季节性特征。近年来，越来越多的研究表明，毛竹中的天然多糖有抗氧化、抗炎、调节肠道微生物等多种生理活性[3-4]。目前，对于毛竹多糖的研究尚存在提取率低，纯度不高等问题，且关于毛竹多糖的结构和物质组成报道较少。因此，本研究以毛竹为研究对象，结合传统的水提醇沉法提取多糖，利用响应面法对提取条件进行优化。同时对其理化性质及初步结构进行探究，以期能更好地开发利用毛竹资源，为毛竹多糖的工业化生产及结构活性的研究提供技术支持和理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

新鲜毛竹采：购于江苏省南京众彩果蔬市场，贮藏于-20 ℃；95%乙醇：无锡市亚盛化工有限公司；葡萄糖标准品：科密欧化学试剂有限公司；牛血清蛋白：惠兴生化试剂有限公司；明胶：九鼎化学有限公司；氯化钡、硫酸钾、咔唑、D-半乳糖醛酸、阿拉伯糖、鼠李糖、半乳糖、甘露糖、木糖、硫酸铁：麦克林生化科技有限公司；盐酸、浓硫酸、三氯甲烷：南京化学试剂股份有限公司；苯酚、溴化钾：国药集团化学试剂有限公司；透析袋MD44（截留分子质量3 500 Da）、考马斯亮蓝G250：北京索莱宝科技有限公司；正丁醇：西陇化工股份有限公司。

1.2 仪器与设备

RE52CS 型旋转蒸发仪：上海亚荣生化仪器厂；FreeZone 4.5Plus 型冷冻干燥仪：美国Labconco 公司；ST-110A 型水分测定仪：厦门易仕特仪器有限公司；GC436 型气相色谱仪：北京布鲁克科技有限公司；Waters1525 型凝胶渗透色谱仪：美国沃斯特有限公司；TENSOR27 型傅立叶红外光谱仪：德国Bruker公司；TM3000 型扫描电镜：日本Hitachi 公司。

1.3 实验方法

1.3.1 预处理

将新鲜毛竹去箨后，用蒸馏水漂洗干净，切成1 cm3的方块并打浆，于55 ℃烘干，粉碎后过60 目筛密封保存。

1.3.2 毛竹多糖的制备

将预处理后的毛竹粉按一定料液比溶于蒸馏水中，在要求的温度下浸提一定时间，采用Sevag 法脱蛋白，离心去除下层有机溶液，加入3 倍体积95%乙醇混匀，静置24 h 后离心收集沉淀，流水透析1 ～2 d，透析液经过冷冻干燥得到毛竹水溶性多糖。按式（1）计算多糖提取率。

式中：c 为毛竹水溶性多糖提取率，%；m1为冻干的水溶性多糖质量，g；m2为毛竹粉质量，g。

1.3.3 提取工艺优化

在前期预实验的基础上，选取料液比（A）、提取时间（B）、提取温度（C）三个因素为自变量进行响应面实验。根据Box-Behnken 原理，以多糖提取率为响应值设计三因素三水平的优化实验，见表1。

表1 响应面分析因素与水平

1.3.4 毛竹多糖化学成分的测定

（1）多糖含量：硫酸-苯酚法[5]。

（2）蛋白质含量：考马斯亮蓝G-250 法[6]。

（3）水分含量：称量多糖样品500 mg，置于托盘上，放入快速水分测定仪，测定水分含量。

（4）糖醛酸含量：硫酸-咔唑法[7]。

（5）硫酸根离子含量：氯化钡-明胶法[8]。

1.3.5 毛竹多糖理化性质的测定

（1）红外光谱分析：取多糖样品1～2 mg，置于玛瑙研钵中充分研磨，加入溴化钾固体粉末150 mg，研磨均匀后用压片机压片，用傅立叶红外分光光度计在4 000～500 cm-1范围内检测红外吸收光谱。

（2）单糖组成分析：采用气相色谱法（GC）[9]。GC分析参数：毛细管柱DB-5MS，载气为氮气，分流比50∶1，检测器温度250 ℃，柱温起始50 ℃，以10 ℃/min 升至230 ℃，汽化室温度280 ℃。

（3）相对分子量测定：采用凝胶渗透色谱（GPC）法[10]。GPC 参数：2414 示差折光检测器；PL aquqgel-OH MIXED 凝胶色谱柱；流动相：0.2 mol/L NaNO3溶液混合0.01 mol/L NaH2PO4溶液配成pH 7 的溶液；流量精度0.1%；流速1 mL/min；柱温30 ℃；进样量10 μL。

（4） 扫描电镜分析：用导电胶将毛竹多糖均匀地粘在样品台上，吹除多余浮粉，喷金镀膜后用扫描电镜在15 kV 加速电压下观察样品在不同倍数下的微观结构。

1.3.6 数据分析

实验数据采用SPSS 25 软件进行单因素分析，采用Design Expert 11 软件对Box-Behnken 响应面设计的数据进行分析。

2 结果与分析

2.1 响应面法优化毛竹多糖的提取条件

2.1.1 响应面实验结果与方差分析

在单因素实验基础上，根据Box-Behnken 原理，采用Design Expert 11软件进行实验设计，结果见表2。以多糖提取率为响应值进行拟合，得到回归方程：

表2 响应面实验设计与结果

为进一步确定回归模型的可靠性，对其进行方差分析，结果见表3。模型的P 值＜0.000 1，表示模型极显著，失拟项不显著（P=0.080 6 ＞0.05），说明该模型拟合度高，实验误差小[11]。决定系数R2=0.981 5，表明模型响应值的变化有98.15%来自所选因变量，进一步表明模型中实验值与预测值符合情况较好，可以用回归方程代替实验真实点，对结果进行分析和预测[12]。由P 值可知，一次项B、C、交互项AB、BC 和二次项A2、B2、C2对提取率均存在显著影响（P ＜0.01），且对响应值的影响大小依次为：B ＞ C ＞ A，验证了上述回归方程得出的影响程度顺序。

2.1.2 两因素交互作用分析与最佳工艺的确定

图1—图3 中响应面曲图的陡峭顺序为AB ＞BC ＞ AC，结合等高线观察发现，AB、BC 等高线呈椭圆形，而AC 更接近圆形，说明料液比与提取温度间交互作用对多糖提取率的影响最明显，其次是提取温度与提取时间的交互作用，而料液比与提取时间的交互作用最不显著。

利用软件Design Expert 11 对拟合方程进行优化，得到提取毛竹多糖的最佳工艺参数为：料液比1∶26.39（g/mL），提取温度77.42 ℃，提取时间3.82 h，毛竹多糖的提取率达到5.22%。综合实际操作的方便性考虑，将最佳工艺条件调整为：料液比1∶27 g/mL，提取温度78 ℃，提取时间4 h，经过3 次验证实验，毛竹多糖最终实际提取率为（5.18±0.07）%，与理论值接近，说明本实验拟合的优化工艺条件具有可行性和实用价值。

2.2 主要成分分析

由表4 可知，BSP 中多糖含量72.14%，较殷凯[13]获得的毛竹粗多糖含量（23.68%）显著提高，但比Zhang 等[14]提取毛竹粗多糖的总糖含量88.40%低，可能与竹笋的产地、采收季节与提取方法不同有关。BSP 中含0.95%蛋白质，该部分蛋白可能是与多糖结合生成糖蛋白而被保留下来，这与吴金松等[15]报道的Sevag 法不能完全脱除多糖中蛋白质的结果一致。BSP 含糖醛酸9.76%，与王静等[9]报道的毛竹多糖中糖醛酸含量8.36%～12.99%的结果一致。此外，BSP 中含有极其微量的硫酸根，而Chen 等[16]和Wu等[17]研究发现方竹、大叶麻竹多糖中不含硫酸根离子，说明不同品种的竹笋多糖，化学组成差异明显。

表3 提取率回归方程的方差分析结果

表4 毛竹多糖的主要化学成分 单位：%

2.3 红外光谱分析

红外光谱图（图4）显示，BSP 在3 419.67、2 928.73、1 652.68、1 558.47、1 418.90 和1 075.50 cm-1有吸收峰。3 419.67 cm-1吸收峰为多糖分子间或分子内氢键O—H 伸缩振动的强吸收峰，2 928.73 cm-1处吸收峰是烷基的C—H 伸缩振动，这两个吸收峰是多糖类的特征峰[18]，1 652.68 cm-1附近的振动是氨基的N—H 变角振动，表明毛竹多糖还含有少量蛋白质，此结果与上述化学成分结果（毛竹多糖含0.95%蛋白质）符合，1 418.90 cm-1处吸收峰为羧基的C ═O 对称伸缩振动，根据化学法分析，此处可能是糖醛酸的羧酸部分[19]，与上述硫酸-咔唑法检测出含有少量的糖醛酸结果一致，说明BSP是一种酸性多糖。1 075.50 cm-1处吸收峰为常见的吡喃型糖环[20]，表明BSP 中存在吡喃型单糖。

2.4 单糖组成分析

BSP 酸解后衍生化的气相色谱如图5 所示。经计算可知其单糖组成及摩尔比为n甘露糖∶n葡萄糖∶n阿拉伯糖∶n木糖∶n鼠李糖∶n半乳糖＝62.52∶23.05∶10.35∶2.78∶0.79∶0.51，其中甘露糖的含量最高，其次是葡萄糖，半乳糖最少。而唐莉莉等[21]提取的毛竹叶多糖中，各单糖摩尔比分别为n甘露糖∶n葡萄糖∶n阿拉伯糖∶n木糖∶n鼠李糖∶n半乳糖＝0.52∶2. 84∶1.08∶0.24∶0.13∶0. 95，含量最高的是葡萄糖，最少的是鼠李糖。可见毛竹不同部位提取的多糖，其单糖的组成类型相同，但含量存在显著差异。

2.5 相对分子质量测定

由图6 可知，BSP 有3 个较明显的峰，但峰3不属于聚合物的峰，可能是由空气、杂质或小分子物质造成的杂峰。峰1 和峰2 为BSP 的峰，保留时间分别为7.400、8.817 min，经计算可知两个主峰的相对分子质量分别是91.11、4.55 kDa。Zheng等[22]曾报道绿竹笋壳提取纯化的多糖相对分子质量为1.63×104kDa，He 等[23]报道了雷竹水溶性多糖相对分子质量为83.50、80.08 kDa；陈光静[24]测定方竹纯化多糖的分子质量为24.58、123.45 kDa。由此可知BSP 的相对分子质量与雷竹多糖最为接近，与其他品种的竹笋多糖相对分子质量相差较大。

2.6 扫描电镜分析

通过扫描电镜可以观察到BSP 的微观结构特征。如图7 所示，放大150 倍时可以清晰地看到BSP 呈光滑的片状，带有部分碎屑物；当放大3 000 倍时，可观察到BSP 截面呈蜂巢状，结构疏松，表面附着许多小颗粒，说明其具有更大的比表面积。这种结构赋予多糖较好的吸附力，说明热水浸提法条件较为温和，BSP 的结构保留较为完整[25]。

3 结 论

以水提醇沉得到的毛竹多糖为研究对象，考察不同料液比、提取温度、提取时间对多糖提取率的影响。在单因素实验基础上，以响应面法优化毛竹多糖的提取工艺，其最佳工艺条件为：料液比1∶27（g/mL），提取温度78 ℃，提取时间4 h，该条件下多糖提取率为（5.18±0.07）%，含量为（72.14±0.02）%。该多糖是一种混合酸性多糖，主要由甘露糖、葡萄糖、阿拉伯糖、木糖、鼠李糖、半乳糖组成，其分子质量集中分布在9.11、4.55 kDa两个主峰。扫描电镜图显示，毛竹多糖呈蜂窝状，附着许多细小颗粒，说明BSP 有较好的黏附能力。