miRNA-21在胆囊癌中的表达情况及对胆囊癌细胞增殖活性的影响

闵捷 沈彬彬 周瑜 李皇保 周俊

胆囊癌是一种常见的消化道恶性肿瘤，其恶性程度高，预后差，5年生存率不到5%，患者平均生存时间小于6个月[1,2]。手术治疗是目前胆囊癌的主要治疗手段[3]。但胆囊癌一经诊断常为中晚期，患者已丧失最佳手术机会，常导致患者预后不良[4]。研究表明miRNA可作为促癌或抑癌因子参与肿瘤的发生、发展和耐药性的产生[5,6]。miRNA-21作为一种促癌基因在多种消化道恶性肿瘤中高表达[7～9]，但其在胆囊癌中的作用尚不明确。本次研究通过下调胆囊癌细胞miRNA-21表达水平，研究miRNA-21与胆囊癌细胞增殖活力的影响。现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择2017年3月至2019年3月期间嘉兴市第一医院肝胆胰外科收治的50例胆囊癌患者的肿瘤组织和癌旁正常组织。

1.2 miRNA-21水平检测 采用Western blot法检测肿瘤组织和癌旁正常组织中miRNA-21水平。

1.3 细胞转染及PCR检测转染结果 利用脂质体LipofectamineTM2000将miRNA-21 inhibitor转染进人胆囊癌细胞株细胞中，标记为miR-21下调组；仅转染脂质体LipofectamineTM2000的一组设置为空白对照组；转染无意义序列miRNA的一组为阴性对照组。转染结束24 h之后利用实时荧光定量PCR检测各组miRNA-21的表达水平，选择10个孔进行计算。

1.4 使用MTT法检测不同组细胞增殖活力 将细胞消化计数，按每孔1×104个细胞接种于96孔板中，每孔加入200 ml培养基。于接种后的24 h、48 h、72 h、96 h、120 h在每组细胞中加入20 µl MTT溶液孵育4 h，然后每孔加入150 µl二甲基亚砜溶液混匀使沉淀溶解，用酶标仪检测490 nm处细胞的光密度值反映细胞增殖活力，记录结果，绘制细胞生长曲线。

1.5 使用流式细胞术检测细胞周期 转染24 h后将细胞消化离心，收集三组细胞，每组设定10复孔，分别放置于15 ml离心管中，每管加入1.5 ml预冷的磷酸缓冲盐溶液和3.5 ml无水乙醇涡旋充分混合，4 ℃固定3 h，1 000 r/min离心5 min洗涤细胞。每管加入10 µl PI染液避光孵育30 min，磷酸缓冲盐溶液洗涤细胞，使用beckman Cyto FLEX流式细胞仪检测细胞周期。

1.6 细胞划痕实验检测不同组细胞迁移能力 消化并收集各组细胞，按每孔5×105个细胞接种于6孔板中培养过夜。次日用无菌白色枪头在孔中央轻轻笔直划痕，随后用磷酸缓冲盐溶液清洗脱落细胞，显微镜下拍照，加入无血清DMEM培养基继续培养，于12 h、24 h观察拍照，计算愈合率，评估细胞迁移能力。

1.7 Western blot法和实时荧光定量PCR技术检测各组细胞中人10号染色体缺失的磷酸酶基因（phosphatase and tensin homologue deleted on chro⁃mosome 10，PTEN）和人凋亡相关因子配体（factor related apoptosis ligand，FasL）的表达情况 收集转染24 h后的各组细胞，每组设定10复孔，分别经磷酸缓冲盐溶液清洗后加入RIPA细胞裂解液于4 ℃低温旋转摇床充分裂解30 min，高速离心后收集蛋白，用BCA试剂盒测定蛋白量。在SDS-PAGE胶中每孔加入20 µg总蛋白进行电泳，根据maker判定蛋白位置。然后进行转膜，将蛋白转入PVDF膜上，5%BSA溶液封闭1 h，将膜与PTEN、FasL和β-actin一抗（1：1000配置）在4 ℃下孵育过夜。将膜用TBST溶液清洗3×10 min后与山羊抗兔二抗（1∶4000配置）室温下孵育2 h，TBST溶液清洗3×10 min后使用显影液进行显影，使用Graphpad 6.0对蛋白表达量进行分析。实验重复进行3次。

Trizol法提取不同组细胞总RNA，使用Nano⁃drop 2 000检测样品吸光度（A260/A280），按照试剂盒说明书进行逆转录和PCR扩增。PTEN上游引物：5’-GCGTACCATGACAGCC-ATCATCAAAGAG-3’，下游引物：5’-CGAAGGTTTCAGACTTTGTAATTTGT⁃GT-3’；FasL上游引物：5’-ATACAGCTGTGGC⁃TACCGGT -3’，下游引物：5’-CTCCAGAT⁃CAAAGCAGTTCC-3’；GAPDH上游引物：5’-TGT⁃GGGCATCAATGGATTTGG-3’，下游引物：5’-ACACCATGTATTCCGGGTCAAT-3’。反应条件为92 ℃预变性5 min，92 ℃60 s、54 ℃30 s、72 ℃30 s，反应32个循环，4 ℃保存。反应结束后计算Ct值，绘制标准曲线，相对表达使用2-ΔΔCt法进行测定。

1.8 统计学方法 采用SPSS 21.0统计学软件进行数据分析。计量资料以均数±标准差（）表示。计量资料比较采用F检验和t检验；计数资料比较采用χ2检验。设P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 胆囊癌患者肿瘤组织与癌旁正常组织中miRNA-21水平进行比较 50例胆囊癌患者肿瘤组织中miRNA-21表达水平（5.92±1.33）高于癌旁正常组织（2.51±0.64），差异有统计学意义（t=16.34，P＜0.05）。

2.2 转染后胆囊癌细胞miRNA-21水平变化 空白对照组miR-21表达量为（0.99±0.09），阴性对照组miR-21表达量为（0.97±0.08），而miR-21下调组miR-21表达量为（0.21±0.07），miR-21 inhibitor转染进人胆囊癌细胞株细胞后，细胞miR-21表达量明显下降，与空白对照组和阴性对照组比较，差异均有统计学意义（t分别=4.86、4.59，P均＜0.05）。

2.3 MTT法检测不同组细胞增殖活力见图1

由图1可见，在接种后24 h、48 h、72 h、96 h、120 h，miR-21下调组细胞的光密度值明显低于空白对照组和阴性对照组，差异均有统计学意义（t分别=4.35、4.55、6.16、7.46、7.90、4.62、4.56、6.19、7.48、7.80，P均＜0.05）。

图1 MTT法检测不同组细胞增殖活力

2.4 流式细胞术检测不同组细胞周期见表1

表1 流式细胞术检测不同组细胞周期

由表1可见，三组不同细胞周期的细胞比较，差异均有统计学意义（F分别=125.90、38.645、23.69，P均＜0.05），miR-21下调组停留在G0/G1期的细胞明显多于空白对照组和阴性对照组，差异均有统计学意义（t分别=12.37、13.25，P均＜0.05），而S期和G2期细胞少于空白对照组和阴性对照组，差异均有统计学意义（t分别=7.06、8.40、5.71、6.02，P均＜0.05）。

2.5 miRNA-21表达水平对胆囊癌细胞迁移能力的影响见图2

图2 细胞划痕实验检测不同组细胞迁移能力

由图2可见，细胞划痕实验结果显示，miR-21下调组的胆囊癌细胞划痕愈合率明显低于空白对照组和阴性对照组，差异均有统计学意义（t分别=5.77、5.98，P均＜0.05）。

2.6 不同组细胞中PTEN、FasL蛋白表达情况见表2

表2 不同组细胞中PTEN蛋白和FasL蛋白表达情况

由表2可见，三组的细胞中PTEN蛋白和FasL蛋白表达量比较，差异均有统计学意义（F分别=303.53、538.81，P均＜0.05）。miR-21下调组细胞中PTEN蛋白和FasL蛋白表达量均高于空白对照组和阴性对照组，差异均有统计学意义（t分别=19.68、19.60、27.45、26.67，P均＜0.05）。

2.7 不同组细胞中PTEN、FasL mRNA表达水平见表3

表3 不同组细胞中PTEN mRNA和FasL mRNA表达水平

由表3可见，不同组细胞中PTEN mRNA和FasL mRNA表达水平，差异均有统计学意义（F分别=258.79、266.53，P均＜0.05）。miR-21下调组细胞中PTEN mRNA和FasL mRNA表达水平均高于空白对照组和阴性对照组，差异均有统计学意义（t分别=16.19、16.12，16.09、17.51，P均＜0.05）。

3 讨论

胆石症、胆囊息肉是胆囊癌的危险因素，直径＞3 cm的胆结石和直径＞1 cm的胆囊息肉被认为更容易诱发胆囊癌。手术治疗是目前胆囊癌的主要治疗手段，但晚期胆囊癌治疗效果不佳，且易复发和转移。

miRNA是一种长度在17～25个核苷酸的非编码小RNA，研究表明miRNA在细胞中参与生命活动的调控，在胚胎时期miRNA-21参与体内多种脏器的发育过程，肺脏、肾脏和多种外分泌腺体的发育依赖miRNA-21的参与[10]。在肿瘤的发生发展过程中miRNA也起重要作用，一些miRNA的表达水平与疾病的发生及预后密切相关。miRNA-21已被证实是一种致癌基因，在多种肿瘤中过表达，且多与疾病的预后不良相关，一些动物实验中下调小鼠体内的miRNA-21水平能够使肿瘤细胞快速凋亡，肿瘤迅速消失[11]。在肾透明细胞癌、肺腺癌、前列腺癌和多种消化道恶性肿瘤中miRNA-21高表达患者预后常较差，而miRNA-21低表达患者预后较好[12]。

PTEN基因于1997年被发现，后被证实是一种抑癌基因，PTEN能够诱导细胞凋亡，防止细胞过度增殖，在多种恶性肿瘤的检测中均发现PTEN基因缺失。近年来有研究表明肿瘤细胞中miRNA-21的表达能够抑制PTEN的表达，促进肿瘤的增殖和转移[13]。PTEN的下游效应蛋白为蛋白激酶B，在调节细胞生长、发育、控制器官大小等多种细胞活动中发挥作用，蛋白激酶B能够使促凋亡因子caspase-3和caspase-9失活，抑制细胞凋亡[14]。FasL是TNF超家族成员之一，通过自身受体Fas诱导细胞凋亡而维持免疫稳态，FasL/Fas介导的细胞凋亡在细胞死亡、终止免疫应答、T细胞和NK细胞的细胞毒作用等方面发挥重要作用[15]。在多种恶性肿瘤中FasL表达缺陷，使其下游蛋白失活，有助于肿瘤的增殖和扩散[16]，但对细胞中FasL的表达水平与miRNA-21水平的关系研究较少。

本次研究发现胆囊癌肿瘤组织中miRNA-21表达水平高于癌旁正常组织（P＜0.05），说明胆囊癌肿瘤细胞中miRNA-21呈高表达状态。转染miRNA-21 inhibitor后miR-21下调组细胞中miRNA-21水平明显低于空白对照组和阴性对照组（P均＜0.05）。MTT法检测细胞活力结果为miR-21下调组细胞增殖活力明显低于空白对照组和阴性对照组（P均＜0.05），说明下调miRNA-21水平能够抑制细胞增殖活力。流式细胞术结果显示下调miRNA-21水平能够抑制细胞周期，使G0/G1期细胞增多（P＜0.05），S期和G2期细胞减少（P＜0.05）。细胞划痕实验结果显示下调miRNA-21水平可以明显抑制肿瘤细胞迁移能力（P＜0.05）。Western blot结果显示下调miRNA-21表达水平能够使PTEN、FsaL蛋白表达增多，而实时荧光定量PCR结果结果显示下调miRNA-21表达水平能够使PTEN mRNA、FsaL mRNA表达水平升高，与文献报道一致[17]。

综上所述，胆囊癌组织中miRNA-21明显高于正常癌旁组织，下调胆囊癌细胞中miRNA-21表达水平能够抑制细胞增殖活力、周期和迁移能力，使细胞内PTEN和FasL表达增高，具有作为胆囊癌治疗新靶点的潜力。