Klotho RNA干扰对人主动脉血管平滑肌细胞增殖、迁移及氧化应激的影响

魏建行，梁 荃，黄仕琼，李利华

（大理大学第一附属医院老年病科，云南大理 671000）

血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells，VSMC）是动脉血管膜的主要细胞成分，通过收缩和舒张血管调节血管张力和直径从而调节血压〔1〕。VSMC的增殖及迁移能力增加，氧化应激水平增加等均在动脉硬化的发生、发展中发挥着重要的作用。VSMC具有很强的可塑性，能够对应激信号进行应答及表型调节。VSMC的表型调节通常是由炎症和损伤触发，如细胞因子和生长因子可以诱导VSMC增殖和迁移，这些因子包括血小板源生长因子、转化生长因子和肿瘤坏死因子等〔2〕。高血压、动脉粥样硬化及血管成形术后再狭窄等都与血管平滑肌细胞表型调节有关，主要表现为从收缩型到分泌型的转变以及增殖和迁移能力增加等〔3〕。

Klotho是重要的抗衰老蛋白，随着年龄增加表达减少，从而可能在动脉硬化以及高血压、冠心病等发病中起重要作用〔4〕。已有研究表明，Klotho通过抑制胰岛素∕类胰岛素生长因子-1（insulin-like growth factor 1，IGF-1）和转化生长因子-β1（trans⁃forming growth factor-β1，TGF-β1）信号通路参与氧化应激、炎症和纤维化的调节〔5〕。然而，国内外对于Klotho表达减少参与动脉硬化的具体机制尚不清楚。本研究用慢病毒干扰Klotho在人主动脉血管平滑肌细胞（human aortic vascular smooth muscle cell，HA-VSMC）中的表达，旨在探讨Klotho低表达对HA-VSMC的增殖、迁移以及氧化应激的影响。

1 材料与方法

1.1 实验材料 HA-VSMC（北纳生物，批号：BNCC338715）；慢病毒（上海吉玛基因）；PCR引物（上海生工生物工程）；Klotho抗体（Abcam公司，批号：EPR6856）；CCK-8试剂盒（美仑生物，批号：MA0218-500T）；Transwell嵌套小室（Corning公司，批号：3422）；超氧化物歧化酶（SOD，南京建成生物工程研究所，批号：A001-3-2）；丙二醛（MDA，北京索莱宝科技有限公司，批号：A003-2）。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞的培养及慢病毒转染 用含有15%胎牛血清的高糖DMEM培养基培养HA-VSMC。用慢病毒shRNA干扰Klotho的表达。Klotho-2073 shR⁃NA（shKlotho-2073）靶点序列为5'-GAGCCGTATA⁃CAAGGAATATG-3'；Klotho-1021 shRNA（shKlotho-1021）靶点序列为5'-CCGAGAGCATGAAGAATA⁃ACC-3'；Klotho-1207 shRNA（shKlotho-1207）靶 点序列为5'-GGATTGACCTTGAATTTAACC-3'；阴性对照shRNA-NC（shNC）靶点序列为5'-TTCTCC⁃GAACGTGTCACGT-3'。以3×105个∕孔的细胞密度铺板，慢病毒同时加入1µg∕mL的聚凝胺（polybrene）72 h后，筛选出当MOI=20时干扰效率最强，弃毒液用于实验。

1.2.2 荧光定量聚合酶链反应（PCR）提取RNA，测定浓度并逆转录为cDNA，以cDNA为模板，进行荧光定量PCR扩增，并检测Klotho、NOX1、NOX2、NOX3、NOX5以及DUOX2 mRNA的相对表达量，以2-ΔΔCt值表示。基因引物序列见表1。

表1 基因引物信息

1.2.3 蛋白质印迹法（Western blot）检测Klotho蛋白的表达 使用慢病毒转染HA-VSMC 72 h后，提取并测定总蛋白浓度，进行凝胶电泳分离，采用半干转法转至PVDF膜上，在5%脱脂牛奶封闭液中室温摇床上封闭1 h后，加入抗Tubulin（1：500）、Klotho（1：1 000）一抗，4℃孵育过夜，TBST洗膜3次（15 min∕次）后，加入相应二抗（1：10 000），摇床室温孵育2 h。TBST再洗膜3次（15 min∕次），加入Pro-light HRP化学发光检测试剂，使用Bio-Rad凝胶成像系统显影，使用Image-pro plus灰度值分析。以Tubulin为内参计算Klotho蛋白水平的相对表达量。

1.2.4 CCK-8检测细胞增殖 将HA-VSMC以4×103个∕孔的细胞密度接种于96孔板，每个样本设5个复孔，另设空白对照孔；分别于0 d（第2天细胞贴壁后）、1、2、3、4、5 d对HA-VSMC进行CCK-8检测。检测前在每孔中加入10µL CCK-8溶液，在细胞培养箱内继续孵育2 h，于酶标仪上测定吸光度（波长为450 nm）。

1.2.5 Transwell检测细胞迁移 常规细胞消化离心，磷酸盐缓冲液（PBS）洗1次，无胎牛血清DMEM培养基重悬，细胞计数，调整细胞浓度，取200µL细胞悬液（2×105个）加入Transwell上室，在Transwell下室加入500µL含15%胎牛血清的培养基，放入37℃、5%CO2培养箱中继续培养；分别于培养2、3、4 d后，固定、染色、干燥后显微镜下随机选取10个不同视野，计算穿膜细胞数并进行统计分析。

1.2.6 SOD以及MDA含量检测 采用细胞裂解液进行检测，具体方法详见说明书。

1.3 统计分析 采用GraphPad Prism 8.0软件进行作图及数据分析。

2 结果

2.1 RNA干扰抑制HA-VSMC Klotho表达 用慢病毒转染HA-VSMC 72 h后，荧光显微镜和荧光定量PCR证明shKlotho-2073显著抑制Klotho的表达，抑制率为86.4%。因此，选择shKlotho-2073（shKlotho）作为干扰载体。通过Western blot进一步证实Klotho蛋白被显著抑制。见图1。

图1 比较评估不同shRNA对HA-VSMCKlotho的干扰效率

2.2 RNA干扰对HA-VSMC的增殖及迁移影响shKlotho干扰HA-VSMC使细胞增殖能力较空白对照孔shNC明显增强，并且随着实验时间的延长差异更加明显，从1 d开始各时间点的差异均具有统计学意义（P＜0.001）。见图2。通过4 d的迁移实验，shKlotho转染的HA-VSMC迁移能力明显增加；Transwell实验结果显示shKlotho组相较于shNC组，穿膜细胞数明显增多，且在3 d以后具有更高的跨膜细胞量（P＜0.01）。见图3。

图2 shKlotho对HA-VSMC的增殖和迁移的影响

图3 荧光显微镜下shKlotho对HA-VSMC迁移影响

2.3 RNA干扰对HA-VSMC氧化应激的影响Klotho RNA干扰后，与shNC组相比，HA-VSMC细胞裂解物中MDA水平显著增加，SOD水平显著降低。与shNC相比，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotin⁃amide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）氧化酶（NOX1，NOX2，NOX3，NOX5和DUOX2）mRNA的相对表达量显著增加。见图4。因此Klotho表达降低可能促进HA-VSMC的氧化应激。

图4 shKlotho对HA-VSMC氧化应激水平的影响

3 讨论

本研究的主要发现是RNA干扰Klotho基因表达减少可促进HA-VSMC增殖及迁移，促进氧化应激水平的增高。本研究结果对于深入了解衰老或疾病状态导致Klotho表达减少进而参与动脉硬化发生、发展提供了重要的理论依据。

既往研究表明抗衰老蛋白Klotho在血管内皮功能障碍、VSMC增殖和迁移、单核细胞趋化和血管组织炎症中起着重要作用〔6〕，且Klotho通过不同的机制参与血管保护（如抑制氧化应激、调节炎症和减少血管钙化）〔7〕。本研究结果和既往的研究结果一致。在大鼠VSMC中，重组外源性Klotho通过NF-κB p65通路调节BAG3表达，并抑制血管紧张素Ⅱ（angiotensinⅡ，AngⅡ）诱导的VSMC增殖和迁移〔8〕。Yu等〔8〕发现AngⅡ可促进VSMC的增殖和迁移，降低SM22α，促进PCNA的表达，提示AngⅡ对VSMC的表型调节有调节作用；而Klotho共处理可以通过抑制NF-kB p65、Akt和ERK通路，使VSMC中收缩蛋白表达增加，增殖蛋白表达减少，细胞骨架发生变化。因此，Klotho能有效抑制AngⅡ诱导的VSMC增殖、迁移和表型调节。而本研究中，我们在HA-VSMC中证实了Klotho低表达可以促进HAVSMC的增殖和迁移，从而可能参与动脉硬化的发生、发展过程。

氧化应激会随着年龄的增长而增加，使血管内皮功能下降，进而导致动脉顺应性降低〔9〕。已经有研究表明，线粒体氧化应激的增加是与年龄相关的动脉硬化的一个促进因素，而主动脉僵硬是高血压的先兆〔10〕。Rakugi等〔11〕发现，Klotho过表达可抑制AngⅡ的表达，减少人脐静脉血管平滑肌细胞中锰超氧化物歧化酶（Mn-SOD）和一氧化氮（NO）的产生。Klotho还通过激活PI3K∕Akt∕eNOS通路并抑制LOX-1表达，上调氧化清除剂（SOD和NO），从而减轻ox-LDL诱导的氧化应激〔12〕。Klotho不仅下调小鼠主动脉血管平滑肌细胞NOX2蛋白表达和细胞内超氧化物生成，而且还能减轻AngⅡ诱导的超氧化物生成、氧化损伤和细胞凋亡，且Klotho诱导的NOX2蛋白表达抑制可能是通过cAMP-PKA途径介导的〔13〕。Wang等〔14〕给自 发 性高 血压 大 鼠 补 充Klotho，不仅降低了NOX2和SOD，还阻止了高血压的发展。可溶性Klotho（1 nm，24 h）可显著诱导HA-VSMC中Nrf2、抗氧化酶HO-1、过氧化物酶1（peroxiredoxin-1，Prx-1）和谷胱甘肽水平的升高。Nrf2的沉默减弱了可溶性Klotho对HO-1和Prx-1表达的诱导〔15〕。因此，我们推测分子Nrf2介导的机制可能是可溶性Klotho在HA-VSMC中发挥保护作用的基础。

细胞内活性氧（reactive oxygen species，ROS）主要是由线粒体和NADPH氧化酶（NADPH oxidase，NOX）产 生〔16〕。ROS的 增 加 可 能 一 部 分 是 由NADPH氧化酶的表达和活性随年龄增长而增加。NOX家族包括NOX1~5和DUOX1~2同种型，NOX1，NOX2，NOX4和NOX5在血管组织中表达〔17〕。除NOX5外，所有NOX亚基均与另一种跨膜蛋白p22phox相互作用，形成膜结合的催化核心〔18〕。我们的研究发现，Klotho的低表达可以增加MDA水平以及NADPH氧化酶（NOX1、NOX2、NOX3、NOX5、DUOX2）的表达，同时降低SOD。其他研究也提示NOX4介导的氧化应激与VSMC的凋亡有关，NOX2和NOX5活性增加能诱导VSMC增殖〔19〕，NOX1介导的ROS生成可以降低脑动脉瘤收缩蛋白的表达〔20〕。因此，Klotho表达减少可促进HA-VSMC氧化应激水平增加。

氧化应激、线粒体功能障碍和衰老与心血管疾病的发病机制密切相关，通过在血管平滑肌细胞中产生ROS作为细胞内信号传导物质，可控制细胞增殖和凋亡〔21〕。最近有研究表明，ROS的产生与VSMCs的增殖、迁移之间存在相互作用〔22〕。Wnt∕βcatenin信号通路与ROS密切相关，且主要通过核氧化还原蛋白（nucleoredoxin）与Dishevelled间的相互作用而发挥作用〔23〕。Chen等〔24〕用Wnt∕β-catenin信号通路抑制剂XAV939对C57BL∕6小鼠进行干预，发现XAV939可抑制内膜形成，表现为内膜面积减少和内膜∕中膜比的降低。研究证实XAV939通过抑制Wnt信号通路，从而抑制VSMC的增殖和迁移及ROS的生成，促使细胞周期停滞，最终抑制了新生内膜的形成。Li等〔25〕亦发现XAV939可以通过抑制肺动脉血管平滑肌细胞增殖进而减轻肺动脉压和右心室肥厚。因此，我们推测Klotho表达减少促进VSMC增殖、迁移以及氧化应激可能与Wnt∕βcatenin信号通路密切相关。同时，Klotho表达减少也可能通过促进氧化应激从而增加血管平滑肌细胞的增殖和迁移能力。

总之，通过RNA干扰Klotho可促进HA-VSMC增殖、迁移以及氧化应激水平增加，可能在动脉硬化发生、发展中发挥重要作用。抗衰老因子Klotho可作为防治动脉硬化的一个新的干预靶点。