有机阴离子转运多肽对白头翁五环三萜皂苷在大鼠肠道吸收的影响*

刘亚丽，徐贞权，李泽协，周明月，魏韶锋，王萌，张凌，管咏梅，李翔，张靖，苏丹

(江西中医药大学 1.药学系；2.科技学院，南昌 330004)

有机阴离子转运多肽(organic anion transporting polypeptides，OATPs)是细胞膜吸收转运的一类重要蛋白，能大量摄取结构各异的体内外化合物进入细胞，对于药物的代谢和消除有重要作用。OATPs是动物及人体内重要的膜转运蛋白，属于溶质载体超家族，广泛分布于胃肠道、肝脏、肾脏、血脑屏障等[1]。研究发现在大鼠的空肠与回肠广泛分布着OATP1和OATP3，其作用与P-糖蛋白相反，它可以将药物从小肠黏膜端转运到肠浆膜端从而增加药物在小肠的吸收[2]。

白头翁为传统的“清热解毒、凉血止痢”中药[3]，近年来发现其有广泛的抗肿瘤活性[4-6]，其中白头翁皂苷B3、BD、B7、B10、B11为其抗肿瘤作用的活性成分[7]。本课题组前期研究发现白头翁皂苷在极低的生物利用度(<2.5%)情况下，白头翁五环三萜皂苷对肝肿瘤的抑制率>60%[6]，提示白头翁皂苷体内抗癌活性显著，但肠道吸收屏障作为阻碍其药效发挥的首要因素不可忽视。

据白头翁皂苷的结构特征和物理特性，该类皂苷含有齐墩果烷母核，在28位均有羧酸取代基[6]，易在体液中水解形成有机阴离子。为确定有机阴离子转运多肽(organic anion transporting polypeptides，OATPs)是否可以作为转运蛋白，通过与药物离子的结合，以原发性主动转运生成的羧酸离子形成的电化学势能差为驱动力影响白头翁皂苷的吸收，从而将白头翁皂苷从高浓度区域转运至低浓度区域，本研究采用大鼠在体单向肠灌流模型研究白头翁皂苷在小肠内的吸收动力学和吸收机制，探讨各肠段的药物吸收速度和程度与口服生物利用度之间的关系，为白头翁皂苷药动学和药效学研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1试剂与药品白头翁药材：干燥白头翁根(购于南昌某药店)。药材鉴定：赖学文教授(江西中医药大学药学院)。存放地点：江西中医药大学药学院中药标本馆。5 种皂苷的标准品：B3、BD、B7、B10、B11，含量 >95%。提取地点：中药固体制造技术国家工程研究中心天然药物部。结构鉴定：质谱(MS)，氢核磁共振谱(1H-NMR)，碳核磁共振谱(13C-NMR)。黄芩苷：含量 >98%，购于中国食品药品检定研究院(批号：110715-201318)。白头翁总皂苷提取物的制备参照文献[5]报道的方法。经检测白头翁皂苷提取物中B3(相对分子质量911.4)、BD(相对分子质量794.3)、B7(相对分子质量895.6)、B10(相对分子质量895.5)和B11(相对分子质量733.5)的含量分别为24.1%，7.4%，12.4%，13.5%和8.5%，占白头翁总皂苷65.9%。OATPs抑制剂：吲哚美辛购于中国食品药品检定研究院(批号：100258-200904)，柚皮素购于中国广州分析测试中心(批号：141016)，乌拉坦(批号：180818)，甲醇为色谱纯，其他试剂为分析纯。Kreb-Ringer's 营养液(K-R溶液)：取氯化钠(NaCl)7.8 g，氯化钾(KCl)0.35 g，氯化钙(CaCl2)0.37 g，磷酸二氢钠(NaH2PO4)0.32 g，碳酸氢钠(NaHCO3)1.37 g，氯化镁(MgCl2)0.02 g，葡萄糖 1.4 g，纯化水配制成 K-R 溶液1 L。

1.2仪器1290型超高压液相色谱(UPLC，美国Agilent公司，配置Agilent 1290 G4220A型四元液相泵，Agilent 1290 G4226A自动进样器，Agilent 1290 G1316C型自动恒温箱)和Agilent 1290 QTRAP 4500型三重四级杆线性离子肼复合质谱(Q-trap-MS，美国AB公司)，3-18K型高速冷冻离心机(德国Sigma公司)，HHS电热恒温水浴锅(上海博迅实业有限公司医疗设备厂)，VORTEX GENIUS3涡旋仪(IKA仪器设备有限公司)，KQ-250 型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)，AUW-220D 型电子分析天平(日本 Shimadzu 公司，感量：0.01 mg)。

1.3实验动物清洁级SD雄性大鼠，体质量(200±20)g，购于江西中医药大学实验动物中心，实验动物使用许可证号：SYXK(赣)2017-0004。饲养环境温度(22±2)℃，湿度(50±20)%。自然光-暗循环饲养3 d。

1.4液相色谱-质谱联用(liquidchromatography-massspectrometry，LC-MS)方法①色谱条件，色谱柱：Agilent C18(100 mm×4.6 mm，2.7 μm，Agilent公司)，流动相A 为甲醇，B为1.0 mmol·L-1醋酸铵溶液，梯度洗脱，洗脱方式见表1。运行时间10 min。柱温：30 ℃，进样量10 μL。

ESI 质谱源参数：干燥氮气流速10 L·min-1；干燥气体温度350 ℃；喷雾器压力344.75 kPa(50 psi)；毛细管电压-4000 V。多反应检测模式(multi reaction detection mode，MRM)进行定量分析。各待测成分的 MRM 参数：B3m/z911.4→603.2，BDm/z749.3→471.5，B7m/z895.6→733.6，B10m/z895.5→733.5，B11m/z733.5→455.4，黄芩苷m/z446.1→157.2。B3、BD、B7、B10、B11和黄芩苷的毛细管传输电压(DP)和碰撞能量(CE)分别为-232，-218，-237，-288，-60，-80 V和(-113.6，-147.2，-104.0，-115.2，-152.0，-56.0)×10-19J(-71，-92，-65，-72，-95，-35 eV)。

②专属性实验：仪器操控、数据采集和数据分析在MassHunter workstation software(revision B.04.00)上进行。在LC-MS方法下，白头翁皂苷和黄芩苷色谱图选择性较好，色谱峰良好，内源性物质无干扰。

③样品处理：取肠吸收液1.0 mL，正丁醇1.0 mL萃取，混匀，静置取上层正丁醇溶液，氮气(N2)吹干，采用含有黄芩苷0.908 μg·mL-1的甲醇20 μL复溶，漩涡振荡1 min，15 000 r·min-1离心 10 min(r=5.0 cm)，取上清液。

④标准曲线的建立：精密称定各标准品分别溶解于甲醇中制成5种白头翁皂苷成分的贮备液，B3为518 μg·mL-1，BD为410 μg·mL-1，B7为719 μg·mL-1，B10为620 μg·mL-1，B11为420 μg·mL-1，黄芩苷(内标)为0.908 μg·mL-1。精密量取白头翁皂苷储备液适量于 10 mL量瓶中，以空白 K-R 溶液稀释至刻度，配制成白头翁皂苷系列标准溶液。

质量控制样品：采用同样方法配制为含 B3(10.18，40.72，162.87 ng·mL-1)，BD(6.67，26.66，106.62 ng·mL-1)，B7(9.15，36.60，146.40 ng·mL-1)，B10(4.08，16.31，65.22 ng·mL-1)，B11(2.93，11.71，46.83 ng·mL-1)的系列溶液。

取系列标准溶液1.0 mL，照“1.4③”项的方法处理。按照“1.4①” 项的LC-MS法，取 2 μL 注入 UPLC-MS/MS 供分析。

记录白头翁皂苷 B3、BD、B7、B10、B11 与内标的峰面积比。以待测成分的浓度为横坐标，峰面积比值为纵坐标，绘制标准曲线。6个浓度水平，各浓度测定3次，重复测定3 d。待测物质的线性范围、回归方程和相关系数见表2。

⑤回收率实验：精密量取质量控制溶液50 μL，用空白肠吸收液稀释至1.0 mL，按照“1.4③”项下方法处理。取上清液20 μL进样测定，计算各待测化合物经提取后得到峰面积与未经提取直接进样获得的色谱峰面积的比值，计算提取回收率。内标物质同法测定。

白头翁皂苷B3、BD、B7、B10和B11的平均提取回收率为74.8%～92.1%，RSD ≤ 8.1%。内标物质的平均提取回收率为(82.7±3.4)%。

⑥精密度和准确度实验：精密量取低、中、高浓度的质量控制样品溶液50 μL，用空白肠吸收液稀释至1.0 mL，按照“1.4③”项的方法处理。各浓度制备6份，连续进样6次，求日内精密度。重复操作，连续3 d测定并制作标准曲线，求日间精密度。准确度通过比较样品的实际浓度与理论浓度，用相对回收率和相对误差来表征。

日间和日内精密度分别为-5.78%～10.09%和2.47%～10.73%，方法准确度为-7.51%～8.92% 和3.31%～11.23%。

⑦基质效应实验：取空白 K-R 溶液 1.2 mL，按照“1.4③ ”项处理方法至氮气吹干，残渣中加入含有内标溶液的质量控制溶液 20 μL，复溶，LC-MS分析，5 个待测化合物和内标的峰面积比值记录为A1。另同法操作，用纯化水替代空白K-R溶液，5 个待测化合物和内标的峰面积比值记录为A2。基质效应=A1/A2×100%。

5种白头翁皂苷基质效应的均值为85.6%～98.8%，RSD≤4.5%。说明在本方法下，内源性物质对 5 种被测化合物的离子化无干扰。

⑧稳定性实验：待测物置37 ℃ 恒温水浴中，分别于0，2，4，6，8，16，24 h取样，并测定峰面积，与零时刻的峰面积比较，样品溶液在各个时间点的峰面积基本保持不变，RSD≤9%，该方法稳定性符合要求。

1.5大鼠在体肠吸收实验分别考察未添加抑制剂(对照组)时各肠段白头翁皂苷的吸收情况和添加抑制剂吲哚美辛、柚皮素对白头翁皂苷吸收的影响。称取吲哚美辛适量置于250 mL量瓶中，用含K-R液的白头翁提取物溶液(0.25 g·L-1)稀释至刻度，混匀，超声溶解，分别配制成含低、中、高浓度吲哚美辛(0.1，0.5，1.0 mmol·L-1)的白头翁灌流液(吲哚美辛低、中、高浓度组)。称取柚皮素适量于250 mL量瓶中，用含K-R液的白头翁提取物溶液(0.25g·L-1)稀释至刻度，混匀，超声溶解，配制成含低、中、高浓度柚皮素(0.1，0.25，0.5 mmol·L-1)的白头翁灌流液(柚皮素低、中、高浓度组)。大鼠在体单向肠灌流实验方法参考文献[8]。

1.6数据处理采用重量法计算吸收速率常数Ka和渗透系数Peff。

公式中：Qin和Qout分别为肠段灌入的灌流液和收集液的体积(mL)(假定灌流液和收集液的密度均为1.0 g·mL-1)，Cin和Cout分别为灌流液和收集液的质量浓度(g·L-1)，Q为灌流速度，V为灌流肠段的体积(cm3)，l和r分别为灌流肠段的肠度(cm)和横截面半径(cm)。

1.7统计学方法数据分析采用GraphPad Prism 7.00版软件，使用双因素方差分析(Two-way ANOVA)，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1肠壁物理吸附的考察剪取0.9%氯化钠溶液清洗过的大鼠十二指肠、空肠、回肠各段10 cm，置于白头翁皂苷K-R液中，于37 ℃振荡孵育2 h，孵育前后分别取样(n=3)，按照“1.4③”项下方法操作，求算白头翁皂苷的浓度，见表 3。大鼠各肠段肠壁对白头翁皂苷无明显物理吸附。

表3 肠壁细胞对白头翁皂苷的物理吸附作用

2.2未添加抑制剂时各肠段白头翁皂苷的吸收情况在十二指肠、空肠和回肠中，白头翁皂苷5种成分在空肠和回肠的Peff差异无统计学意义；B3、B7、B11的Ka在空肠和回肠差异无统计学意义，十二指肠的Ka及Peff均显著大于空肠和回肠，见图1，故认为十二指肠为该类皂苷吸收的主要部位，与此前研究结果一致[8]。

①与十二指肠比较，P<0.01；②与空肠比较，P<0.05；③与空肠比较，P<0.01；④与十二指肠比较，P<0.05。

2.3吲哚美辛对白头翁皂苷吸收的影响结果见图2。与对照组比较，吲哚美辛低、中、高浓度组白头翁皂苷的Ka、Peff均显著降低(P<0.05或P<0.01)，随着吲哚美辛浓度升高，抑制效果越强。

①与对照组比较，P<0.01；②与对照组比较，P<0.05。

2.4柚皮素对白头翁皂苷吸收的影响结果见图3。与对照组比较，柚皮素低、中、高浓度组白头翁皂苷的Ka、Peff均显著降低(P<0.05或P<0.01)，随着柚皮素浓度升高，抑制效果越强。

①与对照组比较，P<0.01；②与对照组比较，P<0.05。

3 讨论

采用单向灌流模型避免了循环灌流法时间长、流速高对肠黏膜的损伤。单向灌流法具有以下优点：①操作简便、技术成熟、可控性强，易于控制实验中药物的浓度、pH值以及灌流速度，可较准确地反映药物在肠道的吸收状况；②具有神经内分泌调节功能，且淋巴液血液供应完整；③避免胃肠道内容物及胃肠运动对实验的影响；④药物吸收后被血液带走可形成漏槽条件；⑤从肠腔侧取样，可排除肝脏首关效应及药物在肠壁组织中的代谢[6]；⑥采用重量法矫正灌流液体积，能显著减少实验误差。

在十二指肠、空肠和回肠的渗透系数表明，十二指肠为白头翁皂苷吸收的主要部位，在空肠和回肠中的吸收要低于在十二指肠，但空肠和回肠吸收能力差异无统计学意义(P>0.05)，与文献[9]报道一致。肠渗透性是药物进行生物药剂分类的基本属性之一[8]，根据其强弱将药物分为高渗透性药物(强吸收成分)和低渗透性药物(弱吸收成分)[10]。根据本实验结果，白头翁皂苷Peff<1.8 ×10-4，应属于低渗透性药物，其发挥药效时多是滞留在肠道内，在研究提高药物发挥疗效机制时可考虑基于肠道吸收前靶点的活性研究[11]。

据白头翁皂苷的结构特征和物理特性，易在体液中水解形成有机阴离子。吲哚美辛为OATP1和OATP3典型的抑制剂；柚皮素为OATP1A2和OATP2B1的典型抑制剂，OATP1、OATP2，OATP3均广泛地分布于肠、肝、卵、巢、睾丸、脾等各组织。研究发现，在大鼠的十二指肠、空肠、回肠等不同部位均可以检测到OATP1、OATP2和OATP3，尤以大鼠空肠中OATP1、OATP2和OATP3含量最高[12]。因此在本实验中选用吲哚美辛和柚皮素来研究OATPs对白头翁皂苷吸收的影响。结果显示，与对照组相比，吲哚美辛和柚皮素均能显著降低白头翁在小肠中的渗透系数。虽然在十二指肠中吲哚美辛和柚皮素对白头翁皂苷的吸收抑制作用比在空肠、回肠中较大，但总体上该两种抑制剂对3个肠段均有抑制作用，因此推断，白头翁皂苷可能为OATP1、OATP2和OATP3的底物。肠细胞上OATPs 可将白头翁皂苷吸收进入到细胞内，与一元羧酸转运体、P-糖蛋白的外排作用形成相互制衡的作用力，共同决定白头翁皂苷的生物利用度。