GC/MS法分析α，β－不饱和醛类香料的转化产物

席 辉，任胜超，卢斌斌，柴国璧，曾世通，王丁众，伍锦鸣，孙世豪*，王 华*，赵瑞峰，宗永立

1.中国烟草总公司郑州烟草研究院，郑州高新技术产业开发区枫杨街2号 450001 2.广东中烟工业有限责任公司技术中心，广州市荔湾区东沙环翠南路88号 510385

α，β-不饱和醛类香料是重要香原料中的一类，这类香料在食品添加剂名单GB 2760—2014中收录60多种［1］，在烟草制品中也有广泛应用［2-3］。这类香料因其α，β-不饱和结构而具有较强的活性，易受到环境条件的影响，该类化学改变时常会引起香料产品品质的改变以致引起安全风险的增加［4-7］。因此，了解这类香料在环境中的转化产物，针对性建立有效检测方法并实施有效监测，对于该类香料产品的品控具有重要意义。

通常情况下，一种化学物质在自然存放的条件下发生化学转化的过程缓慢，开展相关研究通常要借助因素实验。因素实验是化学原料药稳定性研究中的重要方法之一。开展因素实验一个重要目的就是了解影响化合物发生转化的环境因素及可能的转化途径与产物，为建立转化产物的分析方法提供科学依据［8］。为了缩短转化产物形成的过程，因素实验通常在较为极端的条件（例如温度大于60℃）下进行［9］。大量研究［10-14］显示，温度通常是影响一种化学产品在环境中发生化学转化的重要因素。在存放条件下，香料的稳定性也主要受温度、湿度、含氧量、光照等环境因素影响，其中温度是最易于发生改变的环境因素之一。

理论上，单独存放的α，β-不饱和醛类化合物发生化学变化主要源自于环境中氧气引发的自身氧化反应，产物主要是α，β-不饱和酸［15］。对于有机酸的分析一般采用先提取后甲酯化，再借助GC/MS分析的方式。但在这种相对剧烈的衍生化条件下，样品中的不饱和醛可能会对不饱和酸产生干扰，进而影响实验结果。因此，需要寻找更为合适的不饱和酸分析方法。本研究中以常见的7种α，β-不饱和醛类香料为研究对象，借助气相色谱-质谱（GC/MS）方法考察温度因素实验下α，β-不饱和醛类香料的转化产物，并针对主要转化产物建立定量分析方法，旨在为α，β-不饱和醛类香料产品的品质监控提供方法。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂和仪器

实验室室温存放的11个香料样品，分别由北京工商大学、河南中烟工业有限责任公司、上海应用技术大学提供，其中，北京工商大学提供了反式-2-戊烯醛、反式-2-己烯醛、反式-2-辛烯醛、反式-2-壬烯醛和反式-2-癸烯醛5个香料样品；河南中烟工业有限责任公司提供了反式-2-己烯醛、反式-2-十一烯醛和肉桂醛3个香料样品；上海应用技术大学也提供了反式-2-己烯醛、反式-2-十一烯醛和肉桂醛3个香料样品。实验室储存样品的初始纯度和生产厂家与标准样品一致。

反式-2-戊烯醛（97%，北京伊诺凯科技有限公司）；反式-2-己烯醛、反式-2-癸烯醛（98%，阿达玛斯试剂有限公司）；反式-2-辛烯醛（95%）、肉桂醛（99%）（北京百灵威科技有限公司）；反式-2-壬烯醛、反式-2-十一烯醛［95%，西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司］；反式-2-戊烯酸（≥95.0%）、反式-2-癸烯酸（≥95.0%）、反式-2-辛烯酸（≥98.0%）、反式-2-壬烯酸（≥92.0%）、反式-3-己烯酸（≥95.0%，内标）（日本东京化成工业株式会社）；反式-2-己烯酸（≥98.0%，上海梯希爱化成工业公司）；反式-2-十一烯酸（≥95.0%，美国Sigma公司）；肉桂酸（≥99.0%）、二氯甲烷（色谱纯）、乙醇（色谱纯）（德国Merck公司）。上述标准样品储存条件为0～4℃避光冷藏。

Agilent 7890A/5975C型气相色谱-质谱联用仪（美国Agilent公司）；药品稳定性试验箱（上海苏盈试验仪器有限公司）；AB104-S电子天平［感量0.000 1 g，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司］；2 mL白色色谱瓶（美国Agilent公司）；10 mL容量瓶、Transferpette S移液器（德国Brand公司）。

1.2 方法

1.2.1 因素实验

参照化学原料稳定性实验中因素实验的方法进行因素实验，具体步骤：取7种α，β-不饱和醛类样品各0.5 mg，分别置于2 mL无色透明色谱瓶中，置于相对湿度（RH）（60±5）%、温度（80±2）℃的药品稳定性试验箱中，存放2（周）后取出，进行下一步分析。

1.2.2 样品制备及分析

α，β-不饱和醛转化产物定性分析样品的制备：取经过因素实验的样品，直接向每个色谱瓶中移入1 mL二氯甲烷，振荡溶解后，即为α，β-不饱和醛转化产物定性分析样品。

内标标准溶液：取反式-3-己烯酸，以乙醇为溶剂，配制成浓度为22.0μg/mL的溶液，即为内标标准溶液。

标准工作溶液：分别精确称取一定量7种α，β-不饱和酸置于10 mL容量瓶中，以内标标准溶液为溶剂配制标准混合储备溶液；在标准混合储备溶液的基础上，采用等比稀释的方式配制一系列浓度的标准溶液，即为标准工作溶液。

实验室储存香料产品分析用样品的制备：精确称取实验室储存香料产品，以内标标准溶液为溶剂，配制成0.5 mg/mL溶液，采用GC/MS法进行样品分析。分析条件：

色谱柱：DB-WAXETR毛细管柱（60 m×0.25 mm i.d.×0.25μm d.f.）；载气：He，99.999%；流速：1.0 mL/min；进样口温度：250℃；进样量：1μL；进样模式：分流进样，分流比10∶1；升温程序：50℃电离方式：EI；电离能量：70 eV；离子源温度：230℃；传输线温度：280℃；溶剂延迟时间：10 min；扫描模式：定性分析采用全扫描模式，质量扫描范围50～400 amu；定量分析采用SIM模式。各目标物的定量和定性离子如表1所示。

表1 GC/MS分析7种α，β-不饱和酸的SIM扫描参数Tab.1 SIM parameters of GC/MS for seven α，β-unsaturated acids

1.2.3 数据处理与分析

利用Microsoft Excel 2010软件进行数据分析处理。

2 结果与讨论

2.1 温度对α，β-不饱和醛类香料的影响

通常情况下，化合物在环境中的稳定性除受自身结构因素影响外，还受存放环境因素影响，其中温度是主要影响因素之一。以反式-2-己烯醛为例，其在不同温度下存放时的质量百分比变化如图1所示。可以看出，在不同温度下，反式-2-己烯醛的量均会随存放时间的增加逐渐减少；在相同存放时间内，温度越高，其质量百分比下降幅度越大。实验中发现，含有与反式-2-己烯醛类似的α，β-不饱和醛类香料均具有类似特征。这表明，α，β-不饱和醛类香料在环境存放过程中会发生化学转化，而且，温度对该类香料的稳定性有重要影响。

图1 反式-2-己烯醛在不同温度下存放时质量百分比变化Fig.1 Content change of trans-2-hexenal stored at different temperatures

2.2 α，β-不饱和醛类香料转化产物的定性分析

为快速了解α，β-不饱和醛类香料转化产物的种类组成，借鉴药品稳定性实验中的因素实验方法，在极端条件（80℃）下将α，β-不饱和醛类香料存放2周。采用GC/MS法分析经过因素实验得到的样品，考察转化产物的组成特征。以反式-2-己烯醛为例，样品经过因素实验的GC/MS总离子流色谱图如图2所示。借助Wiley标准质谱库比对鉴定化合物，对α，β-不饱和酸类物质采用标准物质进一步确认，结果见表2。可以看出，进行因素实验2周后，7种α，β-不饱和醛类香料均生成多种转化产物，主要为酸类物质，其中以α，β-不饱和酸为主。

显然，这些香料分子因本身结构存在差异，各种α，β-不饱和醛的具体转化产物也存在明显差异。但进一步比较7种α，β-不饱和醛类香料在因素实验下的转化产物可以发现，这些转化产物有一个共同特点，即主要转化产物均是与α，β-不饱和醛对应的α，β-不饱和酸，这与理论结果一致［16］。这说明在存放过程中，α，β-不饱和醛主要发生基于自由基链反应的自身氧化反应［17］。可见，α，β-不饱和酸有望成为α，β-不饱和醛类香料产品化学品质改变的标志物。同时，转化产物中还含有少量的脂肪酸、脂肪醛等物质。原因可能是α，β-不饱和醛在存放过程中先经过逆Aldol反应生成饱和脂肪醛，这些饱和脂肪醛进一步氧化生成饱和脂肪酸［18］。

另取一组α，β-不饱和醛类香料样品，在80℃下存放，每间隔1周取样，以内标标准溶液溶解，进行GC/MS定量分析，连续测试7周，考察α，β-不饱和醛和相应酸质量百分比的变化，结果见图3。可以看出，随存放时间的增加，样品中α，β-不饱和酸的量呈增加趋势，而相应醛的量呈降低趋势。这表明，α，β-不饱和醛和相应酸的化学转化关系密切，可以指示α，β-不饱和醛类香料的化学转化程度。

2.3 α，β-不饱和酸的GC/MS定量分析

综上可知，α，β-不饱和酸是相应醛类香料在环境中化学转化的主要产物，可以指示α，β-不饱和醛类香料化学转化的程度，因此，针对性建立α，β-不饱和醛类香料中α，β-不饱和酸的检测方法对于α，β-不饱和醛类香料的品质监控具有重要意义。在本研究中，结合定性分析结果，建立了分析7种α，β-不饱和酸的GC/MS方法。

图2 香料样品的总离子流色谱图Fig.2 Total ion chromatograms of flavor samples

表2 因素实验条件下α，β-不饱和醛的转化产物Tab.2 Converted products ofα，β-unsaturated aldehyde under factor experiment conditions

图3 在80℃条件下α，β-不饱和醛类香料存放过程中α，β-不饱和酸和醛量的变化Fig.3 Changes ofα，β-unsaturated acid and aldehyde contents inα，β-unsaturated aldehyde flavor stored at 80℃

在定性分析α，β-不饱和酸时，发现使用DBWAXETR色谱柱时，α，β-不饱和酸的色谱峰形较好。为尽可能避免衍生化反应过程，简化分析方法，将获取的样品直接进行GC/MS分析。结果显示，在优化的色谱条件下，7种待测α，β-不饱和酸类物质及内标化合物在30 min内即能流出，分析时间短，分离效果好。采用优化后的色谱条件考察了系列浓度的α，β-不饱和酸标准混合工作溶液，7种α，β-不饱和酸类物质的典型色谱图如图4所示。

以目标物峰面积与内标峰面积之比（y）对相应浓度（x，μg/mL）进行回归，得到各目标物的标准工作曲线、线性范围；对最低浓度的标准混合工作溶液重复分析10次，计算结果的标准偏差（SD），分别以3倍SD和10倍SD计算方法的检出限（LODs）和定量限（LOQs）；采用本方法重复5次测试因素实验样品，以测试结果的相对标准偏差（RSD）表示方法的精密度。结果（表3）表明，本方法的线性、精密度和灵敏度良好，能够满足分析要求。

图4 采用GC/MS-SIM法获取的7种α，β-不饱和酸的色谱图Fig.4 Chromatograms of sevenα，β-unsaturated acids by GC/MS-SIM

表3 7种α，β-不饱和酸的标准曲线、相关系数、线性范围、检出限和定量限Tab.3 Calibration equations，correlation coefficients，linear ranges，LODs and LOQs of sevenα，β-unsaturated acids

2.4 实验室储存α，β-不饱和醛类香料检测结果

收集不同实验室在常温下存储的α，β-不饱和醛类香料样品，以内标标准溶液为溶剂，配制0.5 mg/mL乙醇溶液，采用本方法进行分析，结果见表4。可以看出，从各实验室收集到的α，β-不饱和醛类香料样品中均检测出相应的α，β-不饱和酸类物质，各种α，β-不饱和酸的质量分数介于15.8～450.6 mg/g之间。这表明，常温下，实验室储存的α，β-不饱和醛类香料产品均会发生一定程度的化学变化。

进一步比较来源于不同实验室的反式-2-己烯醛、反式-2-十一烯醛、肉桂醛等香料中α，β-不饱和酸的质量分数可以看出，储存时间与α，β-不饱和酸的质量分数密切相关，对于同一香料样品而言，存放时间越长，α，β-不饱和酸的质量分数越高。这与因素实验结果一致，也进一步提示，α，β-不饱和酸是对应醛类香料产品化学品质变化的指标性产物，可作为标志物用于α，β-不饱和醛类香料样品化学品质的评价。

表4 实验室储存的11个α，β-不饱和醛类香料样品中α，β-不饱和酸的质量分数Tab.4 Contents ofα，β-unsaturated acids in 11α，β-unsaturated aldehyde flavor samples stored in laboratories

3 结论

①α，β-不饱和酸类物质是α，β-不饱和醛类香料的主要转化产物，α，β-不饱和酸或可作为α，β-不饱和醛类香料化学品质变化的标志物。②建立的不饱和烯酸类物质的GC/MS分析方法的灵敏度高（LODs＜0.12μg/mL）、精密度好（RSDs＜4.5%），适用于α，β-不饱和烯醛类香料样品中α，β-不饱和酸的检测。③对不同实验室储存的11个α，β-不饱和醛类香料样品抽样检测结果显示，温度因素实验样品和实验室存放样品中α，β-不饱和酸类物质质量分数与存放时间均呈正相关关系。