mTOR介导的细胞自噬在依维莫司治疗甲状腺癌中的作用及机制

王 宁，刘金彪

(河南科技大学第一附属医院甲状腺外科,洛阳 471003)

目前，甲状腺癌已成为全球范围内发病率上升最快的内分泌系统恶性肿瘤，但在临床上其具体的发病机制尚未明确，多认为是由碘摄入不足或过量、接触大量放射性碘或颈部放射线照射等原因引起甲状腺激素异常分泌，最终导致甲状腺细胞的恶变及癌变[1-2]。甲状腺癌大多因无痛性颈部肿块就诊，并伴有呼吸困难、声音嘶哑等；部分患者可能会出现淋巴结及远处器官组织的侵犯和转移[3-4]。甲状腺癌根据病理类型主要分为乳头状癌、滤泡状癌、未分化癌和髓样癌，其中以乳头状癌最为常见[5-6]。由于甲状腺癌对一般的临床化疗药物并不敏感，因此选择特异性的靶向治疗药物已成为临床治疗的主要研究方向。依维莫司能通过持续有效地抑制哺乳动物的雷帕霉素靶蛋白(mTOR)，发挥抑制肿瘤新生血管形成、肿瘤生长与增殖、肿瘤营养代谢等三重抗肿瘤作用[7]。国外的研究中[8]，依维莫司在临床上批准用于治疗晚期乳腺癌、肾癌等，但依维莫司对于甲状腺癌的疗效及具体机制尚未明确。本研究主要通过给裸鼠甲状腺癌动物模型进行依维莫司药物治疗，观察和探讨依维莫司对甲状腺恶性肿瘤的治疗和缓解作用，及mTOR介导的细胞自噬信号通路在此过程中的重要作用。

1 材料与方法

1.1 药品与试剂

依维莫司(瑞士诺华制药有限公司，注册证号H20150093，规格2.5 mg/片)；多克隆抗体mTOR、LC-3II、p62、Atg5、NF-κB、三磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH,美国SantaCruz生物技术有限公司)；山羊抗兔IgG二抗(AP碱性磷酸酶标记，上海碧云天生物工程有限公司，批号A0423，100 μl)。NIH3T3 “HOOK3-RET”所构建的稳定细胞株，甲状腺癌细胞株SW579(中国科学院细胞库)。

1.2 仪器

Prime Script®RT和SYBR Premix Ex TaqTMII试剂盒(日本TaKaRa生物技术有限公司)。

1.3 实验动物

SPF级BALB/C裸鼠，雌性，5～8周，体重15～20 g，实验室许可证号：SYXK(豫)2019-0002。昼夜循环光照(12 h/12 h)，温度为(22±2)℃。选用小鼠胚胎成纤细胞(NIH3T3)稳定细胞株构建甲状腺肿瘤BALB/C裸鼠皮下移植模型，随机分为对照组、模型组和治疗组，每组30只。参考李毅等[2]构建BALB/C裸鼠甲状腺肿瘤的皮下移植模型的方法：采用含15%胎牛血清的培养液，37 ℃、5% CO2适应性培养NIH3T3 1周，待细胞覆盖率达80%～90%左右，用0.25%胰酶消化，1000 r/min离心10 min，并制成单细胞悬液，调整其浓度为1×107/ml。于裸鼠的颈背部皮下注射细胞悬液100 μl。每隔1天称量裸鼠体重，精密测量裸鼠肿瘤体积。治疗组：造模成功后给予依维莫司(1.5 mg/kg)连续灌胃(ig)给药30天[8]。模型组：造模成功后给予生理盐水(1.5 mg/kg)连续灌胃给药30天；对照组：未进行造模实验，并灌胃给予等计量生理盐水。

1.4 细胞分组和处理

研究发现依维莫司抑制细胞半数增殖的浓度为7.5 nmol/L[9]，因此将5 nmol/L定义为低剂量，10 nmol/L定义为高剂量。用不同浓度的依维莫司处理SW579细胞株培养48 h，分别为空白组、低剂量组和高剂量组(依维莫司0、5和10 nmol/L)制备成细胞悬液接种于96孔板中，更换培养基后加入10 μl CCK8试剂，37 ℃、5% CO2条件下培养2 h，赛默飞FC/K3全自动多功能酶标仪(赛默飞世尔科技)在450 nm波长处测定吸光度(A)值，并计算SW579细胞存活率。用AnnexinV-FITC细胞凋亡检测试剂盒进行染色，贝克曼库尔特Cyto FLEX流式细胞仪(美国贝克曼库尔特有限公司)检测SW579细胞凋亡率，象限取Q2，检测晚期细胞凋亡。

1.5 肿瘤指标观察及测定

依据O’Reilly等[10]的研究，使用依维莫司(1.5 mg/kg)进行小鼠实验。依维莫司连续灌胃给药30天结束后，麻醉处死全部小鼠并获取甲状腺肿瘤，用游标卡尺测量移植瘤长径(L)和短径(W)，计算肿瘤体积：V=L×W2×0.52，测定甲状腺肿瘤裸鼠瘤体体积和重量。然后将瘤体固定于10%中性福尔马林，采用石蜡包埋，常规脱水、透明及浸蜡包埋，连续石蜡切片6张(5 μm/张)，切片用于HE染色。

1.6 Western Blot法检测甲状腺癌组织相关蛋白表达水平

取BALB/C裸鼠甲状腺肿瘤组织剪碎后放入匀浆器反复抽吸，12 000 r/min(4 ℃)离心10 min，提取蛋白，调整蛋白水平为30 μg/μl。各组蛋白样品在10% SDS聚丙烯酰胺凝胶中进行凝胶电泳和转膜，加入大鼠多克隆抗体mTOR、LC-3II、p62、Atg5、NF-κB、GAPDH和二抗。显色采用ECL显色剂，Bio-Pro Bio-Red XRS+凝胶成像分析仪(美国伯乐生命医学产品有限公司)成像，各泳道条带进行灰度扫描得出相应蛋白表达量，采用Quantity-one软件进行分析。

1.7 统计学处理

2 结果

2.1 裸鼠瘤体体积和重量

模型组和治疗组裸鼠在细胞移植后逐渐成瘤，治疗前瘤体体积和重量无统计学差异(P>0.05)。随移植时间延长，模型组裸鼠的瘤体体积和重量逐渐增大(P<0.05)；给予依维莫司后，治疗组裸鼠的瘤体体积和重量逐渐降低(P<0.05)。见表1和图1。

表1 裸鼠瘤体体积和体重变化情况

图1 裸鼠瘤体图片

2.2 HE染色结果

对照组裸鼠甲状腺细胞轮廓正常清晰、胞浆丰富、核仁明显、异型性明显；模型组和治疗组甲状腺细胞呈岛状生长方式，可见细胞坏死、细胞核分裂增多、细胞轮廓消失模糊不清；治疗组较模型组甲状腺细胞恢复，甲状腺细胞坏死数量减少、异型性降低。见图2。

图2 甲状腺细胞HE染色结果(400×)

2.3 Western Blot法检测蛋白表达水平

与对照组相比，模型组和治疗组LC-3II、Beclin-1和Atg5蛋白水平降低，模型组mTOR、p62和NF-κB蛋白水平增加(P<0.05)；与模型组相比，治疗组LC-3II、Beclin-1和Atg5蛋白水平升高，mTOR、p62和NF-κB蛋白水平降低(P<0.05)。见图3。

与对照组相比，a：P<0.05；与模型组相比，b：P<0.05

2.4 SW579细胞存活和细胞凋亡检测

低剂量组和高剂量组的SW579细胞存活率均低于对照组，而SW579细胞凋亡率均高于对照组；随着依维莫司剂量的升高，SW579细胞存活率降低，SW579细胞凋亡率升高(P<0.05)。见图4。

与对照组相比，a：P<0.05

3 讨论

mTOR是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，具有调控细胞生长、增殖与能量代谢的作用，可以抑制细胞自噬的发生[11-12]。有研究证明[13-14]，AMPK/AKT/mTOR信号通路与甲状腺肿瘤的发病机制密切相关。活化的腺苷酸活化蛋白激酶AMPK可以负调节mTOR，在富含氨基酸和营养生长因子等充足时，细胞中被激活的mTOR可以阻断下游自噬通路；反之mTOR活性受抑制，从而解除对自噬通路的抑制。细胞自噬与细胞增殖和存活等多种信号传导密切相关，可加速诱导细胞的损伤和死亡[15]。自噬激活的主要细胞学标志LC3存在于前自噬泡和自噬泡膜表面，主要用于调控mTOR信号通路[16]。Beclin1的复合体Beclin1-PI3KC3通过LC3结合参与自噬体的形成，p62是SQSTMI编码的泛素结合蛋白，其参与自噬相关蛋白和泛素蛋白酶系统降解[17-18]。下游NF-κB是mTOR信号通路的主要效应靶蛋白，可调节细胞凋亡及凋亡基因的转录调控[19-20]。

本研究结果表明，模型组和治疗组裸鼠在细胞移植后逐渐成瘤。随移植时间延长，模型组裸鼠的瘤体体积和重量逐渐增大；给予依维莫司治疗后，治疗组裸鼠的瘤体体积和重量逐渐降低。同时发现对照组裸鼠甲状腺细胞轮廓正常清晰、胞浆丰富、核仁明显、异型性明显。模型组和治疗组甲状腺细胞呈岛状生长方式，可见细胞坏死、细胞核分裂增多、细胞轮廓消失模糊不清；治疗组较模型组甲状腺细胞恢复，说明给予裸鼠依维莫司治疗后可有效缓解裸鼠体内的成瘤情况和改善甲状腺组织的损伤。低剂量组和高剂量组的SW579细胞存活率均低于对照组，而SW579细胞凋亡率均高于对照组；且随着依维莫司剂量的升高，SW579细胞存活率降低，SW579细胞凋亡率升高(P<0.05)，说明依维莫司可诱导SW579细胞凋亡，且随着剂量的增加，其效果越强。模型组和治疗组LC-3II、Beclin-1和Atg5蛋白水平降低；mTOR、p62和NF-κB蛋白水平增加；与模型组相比，治疗组LC-3II、Beclin-1和Atg5蛋白水平升高；mTOR、p62和NF-κB蛋白水平降低，说明依维莫司可有效抑制mTOR靶点，调控细胞自噬通路，从而抑制甲状腺肿瘤生长与增殖的发生、发展过程。

综上所述，mTOR及其诱导的细胞自噬信号通路在甲状腺癌的发生、发展及治疗过程中具有一定的调控作用；且mTOR抑制剂依维莫司可以通过抑制mTOR介导的自噬信号通路来促进甲状腺癌细胞的凋亡，起到治疗甲状腺癌的作用。