西藏牦牛源腹泻病原菌的分离鉴定及耐药性研究

张开琴，王 刚，穷 珍，巴 桑，次旺罗杰，石 次，索朗斯珠

（西藏农牧学院 动物科学学院 西藏高原动物疫病研究自治区高校重点实验室，西藏 林芝 860000）

牦牛是高寒地区的特有牛种，草食性反刍家畜，常见于西藏、青海等高寒高海拔地区，以前被农牧民作为劳役劳动力使用，其饲养模式多为放牧散养和部分半舍式饲养[1]。牦牛大肠杆菌病是由大肠杆菌感染牦牛引起的一种以腹泻、败血症为主要特征的急性传染病，在西藏牧区流行较为普遍，不仅影响牦牛健康，还制约牦牛养殖业的发展[2]。大肠杆菌在牦牛体内属于常在菌，可通过致病性大肠杆菌感染导致牦牛腹泻，严重时还会发生死亡，目前主要依靠抗生素进行大肠杆菌病的预防和治疗，易产生耐药性[3]。大肠杆菌病的耐药性问题已日趋严重，也从未停止过对其耐药性的监测[4-7]。大量试验证实大肠杆菌可经接合、转座等方式进行水平传播[8]，临床可通过检测耐药基因的存在情况，对耐药流行情况进行实时监测。本试验以拉萨市林周县牦牛腹泻粪便为靶标，通过常规的细菌学实验技术进行腹泻病原菌的分离鉴定，然后使用国际公认的K-B纸片法对常用抗生素的药物敏感性情况进行监测[9]。

1 试验材料

1.1 样品来源

本试验的40份牦牛腹泻粪便均采集于拉萨市林周县某牛场。

1.2 质控菌株来源

质控菌株为大肠埃希氏菌ATCC25922，购自中国兽医药品监察所。

1.3 主要试剂

氯霉素、青霉素、多粘菌素B等15种抗菌药物均购自杭州微生物试剂有限公司，普通肉汤培养基、普通琼脂培养基、麦康凯培养基均购自杭州微生物试剂有限公司，沙门菌分离鉴定所用培养基干粉均购自美国BD公司，PCR试剂、核酸染料4S Red plus等购自上海生物工程有限公司。

1.4 主要仪器

高速离心机centrifuge 5804，由德国Eppendorf公司生产；PCR扩增设备，由美国Bio-Rad公司生产；移液器，由德国Eppendorf公司生产；核酸蛋白测定仪，由Thermo公司生产。

2 试验方法

2.1 生化试验

取纯培养物进行常规生化试验，并按照说明书判定反应结果。

2.2 药敏试验

药敏试验按照CLSI推荐的K-B法进行。抑菌结果可依据表1所列标准进行判定[10，11]。

2.3 引物设计

从GenBank中检索已登录的信息，用DNA Star软件找出保守序列，然后采用Primer 5设计16S rRNA序列P基因引物（F:5′-ATGGCTCAGA TTGAACGC-3′；R：5′-CAGGTTCCCCTAC GGTTA-3′，Product：1 500 bp），沙门菌肠毒素Stn基因引物（F:5′-CTTTGGTCGTAAAATA AGGCG-3′；R：5′-TGCCCAAAGCAGAGA GATTC-3′，Product：260 bp）[12,13]，引物序列送生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

2.4 PCR检测

反应体系及条件参照相关文献[14]，扩增后PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，并用凝胶成像仪读数。

3 结果

3.1 腹泻病原菌的分离鉴定

3.1.1 培养特性 根据分离菌株在培养基上的生长特性，结合染色镜检最终鉴定出40株革兰氏阴性分离菌株均符合大肠杆菌特性；XLT4平板上未见黑色中心，周围有透明晕环菌落，再经过Stn基因的分离检测也未见目的条带，可见粪检病原菌中无沙门菌存在。

3.1.2 生化特性 生化特性检测发现分离菌株基本符合大肠杆菌的生化培养特征，再结合其培养特性和形态特征，将造成此次牦牛腹泻的病因归结于大肠杆菌病。

3.1.3 16S rRNA序列P基因的扩增 由图1可知，扩增所得片段大小约为1.5 kb，条带单一，无明显非特异性扩增现象。部分菌株的P基因扩增结果见图1，在1 500 bp左右有特异性条带，与目的条带大小一致。

表1 12种抗菌药物的药敏试验判定标准

图1 部分菌株的P基因电泳

3.2 药敏试验

40株西藏牦牛源大肠杆菌对12种常见药物均存在不同程度的耐药性，具体数据见表2。

表2 40株大肠杆菌分离株药敏试验结果

4 讨论

4.1 西藏牦牛源腹泻病原菌分离鉴定结果

通过细菌分离鉴定，共获得40株西藏牦牛源大肠杆菌，确定导致此次牦牛腹泻的主要原因是大肠杆菌病。

4.2 西藏牦牛源腹泻病原菌耐药性流行特点

药物敏感性结果显示，本试验所分离的腹泻病原菌对青霉素、磺胺类药物的耐药率分别为60%、82.5%，由此可见西藏牦牛源大肠杆菌对常用抗生素存在一定的耐药性，尤其对磺胺类药物耐药性最严重。结合药敏试验结果，建议该牛场可优选氨基糖胺类和喹诺酮类药物进行治疗。

4.3 合理用药，减少耐药现象

细菌耐药性问题已成为国际难题，本研究也发现分离菌株对常用抗生素存在一定的耐药性。因此，临床用药时要注意合理使用抗生素，并对耐药流行情况进行监测以防耐药性的产生[15]。