中国单增李斯特菌的基因组特征研究

2021-06-03 08:18宋泽萱纪顺师王怡倩李玲玲叶长芸
中国人兽共患病学报 2021年5期
关键词:单增家系李斯特

宋泽萱,纪顺师,王 艳,王怡倩,毛 盼,李玲玲,叶长芸

单增李斯特菌(Listeriamonocytogenes)是一种革兰阳性、兼性厌氧、胞内寄生并在环境中广泛存在的食源性条件致病菌[1]。人感染可以引起败血症、脑膜炎及孕妇流产、死胎等侵袭性疾病,特别是老年人、儿童、孕妇和免疫缺陷患者等高危人群易感[2]。单增李斯特菌广泛存在于多种食物当中,如生肉、即食食物、牛奶、蔬菜、冰淇淋和水产品等,具有较大的人群健康风险[3-5]。我国目前报道的单增李斯特菌所致的临床病例呈散发存在[6-7],Li W等报道2013-2017年从我国64家哨点医院共监测到211例李斯特菌病例[8]。

单增李斯特菌分为4个家系和14个血清型,大多数菌株属于家系Ⅰ(包括4b、1/2b、3b、4d、4e和7血清型菌株)和家系Ⅱ(包括1/2a、1/2c、3a、3c和4h血清型菌株),只有少数菌株属于家系Ⅲ和家系Ⅳ(包括4a、4c和4b血清型菌株)[1,9]。食品和临床分离菌株的主要血清型为1/2a、1/2b、1/2c和4b型,而大多数李斯特菌病的暴发与4b血清型相关[9]。根据多位点序列分型可将单增李斯特菌分为不同的序列型(sequence types, STs),仅相差一个等位基因的序列型归为同一克隆群(clonal complexes, CCs)。大量单增李斯特菌流行病学研究发现不同型别菌株在病人和食品中的分布有所差异,这种现象可能与菌株携带的毒力和环境抗性基因不同有关[10]。一些克隆群菌株携带高毒力的基因,如毒力岛(Listeria pathogenicity island,LIPI)LIPI-3和LIPI-4[11-12],而一些克隆群菌株携带环境抗性基因,如压力生存岛1(stress survival islet 1,SSI-1)[13],李斯特菌基因组岛(Listeria Genomic Island,LGI)LGI1和LGI2[14-15]。

李斯特菌病的人群发病率相对较低,但其病死率可达20%~30%,近年来我国李斯特菌病例报道逐渐增多[8]。该病潜伏期较长、早期临床症状不典型[2,16],给临床李斯特菌病的早期确诊带来一定难度。我国市场零售食品中单增李斯特菌的污染率相对较高并存在持续污染情况[17],对公众健康具有潜在风险。

近年来研究发现,我国单增李斯特菌在食品和临床样本中的型别分布具有相似性,但ST优势型别有明显差异。食品菌株的ST优势型别为ST9、ST8和ST87型[3,17-18],不同地区分离的临床菌株型别具有一定差异[8,18-21],ST87型是我国临床菌株中最常见的型别[22]。目前部分菌株已有基因组信息,但针对我国不同来源菌株基因组特征的深入比较分析尚未见报道。

因此,本研究对目前NCBI数据库中已经公布的146株中国单增李斯特菌基因组进行比较分析,根据菌株的基因组特征,分析不同家系和克隆群菌株之间的种群特点及遗传特征的差异,为了解我国单增李斯特菌不同型别菌株的传播特点和致病能力提供参考信息,进而为我国李斯特菌病的预防控制提供依据。

1 材料和方法

1.1菌株选择 根据目前已有的文献报道[12, 20-21, 23-24],在NCBI(National Center for Biotechnology Information)数据库中下载来源于中国不同省份(浙江、上海、广东、江苏、北京、四川、云南、新疆和河北)的146株单增李斯特菌的基因组(表1),其中食品、临床、动物、环境样本来源的菌株分别为74株、31株、30株和8株,有3株样本信息不详。

表1 本研究用于基因组分析的146株单增李斯特菌信息

1.2全基因组分析 使用Prokka(v1.14.6)软件对所有菌株的基因组进行基因功能注释。使用软件Roary(v3.13.0)对146株单增李斯特菌的基因组进行泛基因(pan gene)和核心基因(core gene)分析,鉴定菌株中core-pan 基因的数量比例。使用软件FastTree对核心基因(core gene)采用最大似然法构建系统发育树。

1.3血清型鉴定 通过本地BLASTN软件鉴定单增李斯特菌血清型分型基因(lmo0737、lmo1118、ORF2819、ORF2110、prs、LMxysn_1095、lmo1083和smcL),根据菌株携带的不同基因组合情况判定菌株的血清型[1, 25]。

1.4MLST型别分析 使用本地mlst软件(Seemann T,mlst),根据7个管家基因(abcZ、bglA、cat、dapE、dat、ldh和lhkA)的位点序列,对所有菌株进行ST型别鉴定。CCs克隆群的鉴定通过与巴斯德数据库(https://bigsdb.pasteur.fr/listeria/listeria.html)进行比对后确定。

1.5质粒的预测 使用本地软件ABRicate(v1.0.0),将所有菌株的基因组与plasmidfinder数据库进行查找比对,根据质粒复制起始蛋白编码基因repA的有无鉴定质粒是否存在[26]。

1.6毒力基因分析 通过在线毒力基因查找软件VirulenceFinder2.0(https://cge.cbs.dtu.dk/services/VirulenceFinder/)对所有基因组中已知的106个毒力基因进行分析鉴定(序列一致性>85%,序列覆盖度>80%),其中已知毒力基因参考序列均来源于EGD-e菌株(NC_003210.1)。使用软件Diamond(v0.9.32)对参考菌株EGD-e(NC_003210.1)的内化素蛋白A(InlA)全长氨基酸(800 aa)建立本地数据库,使用BLASTX软件将所有基因组序列与本地数据库进行比对,比对序列中若出现*,则表示该基因组中InlA蛋白发生了提前终止(premature stop codon,PMSC)。

1.7抗性相关基因组岛分析 将压力生存岛SSI-1(NC_003210.1)、SSI-2(HG813249.1)、李斯特菌基因组岛LGI1(CP001602.1)和LGI2(NZ_CM001159.1)基因序列分别与全部菌株基因组进行比对。以上基因组岛均使用本地BLASTN软件进行分析鉴定,要求满足核酸序列一致性和序列覆盖度均≥85%。

1.8统计分析 应用Microsoft Excel 2010软件构建数据库,分析家系Ⅰ和家系Ⅱ菌株中质粒和压力生存岛SSI-1的携带情况。采用SAS 9.4软件进行统计分析,家系Ⅰ和家系Ⅱ菌株中质粒和压力生存岛的携带率差异采用卡方检验(χ2检验)。检验水准为α=0.05。

2 结 果

2.1菌株家系和血清型 本研究中,146株单增李斯特菌共分为3个家系(家系Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ)和6种血清型(1/2b、4b、1/2a、1/2c、4h和4a/4c)(图1)。家系Ⅰ和Ⅱ菌株来源多样(食品、临床和环境),而家系Ⅲ菌株中除1株来源不详外,其余均来源于动物。不同家系菌株血清型具有差异,家系Ⅰ菌株为1/2b 和4b血清型,而家系Ⅱ菌株为1/2a、1/2c、4h血清型,家系Ⅲ菌株为4a/4c血清型。

2.2ST型别和CC克隆群 本研究中单增李斯特菌型别多样,包括27个ST型别和20个CC克隆群(图1)。不同来源(食品、临床、动物和环境)菌株均由多种克隆群组成,其中食品、临床和动物菌株的优势克隆群分别为CC9、CC87和CC2,优势ST型别分别为ST9、ST87和ST145。

2.3基因组特征 146株单增李斯特菌的泛基因(pan gene)共有8 538个基因,核心基因(core gene)有1 926个基因。基于核心基因(core gene)构建系统发育树,发现相同血清型和克隆群的菌株聚集在一起,菌株之间无明显的地域和来源(食品、临床、动物和环境)聚集性(图1)。

菌株家系、血清型、克隆群、ST型别、分离省份、分离时间依次从内向外进行标注,菌株来源、血清型、菌株家系和携带的可移动元件的颜色标注见右侧图例说明。

2.4质粒携带情况 65株(44.5%,65/146)单增李斯特菌携带有质粒(图1),其中家系Ⅱ菌株的质粒携带率(71.4%,45/63)高于家系Ⅰ菌株(26.3%,20/76),差异具有统计学意义(χ2=28.1,P<0.01)(表2)。不同ST型菌株的质粒携带率有所差异,家系Ⅱ中ST155、ST9和ST8型菌株的质粒携带率较高,分别为100.0%(13/13)、75.0%(12/16)和69.2%(9/13)。

表2 家系Ⅰ和家系Ⅱ菌株的质粒和压力生存岛(SSI-1)携带情况

2.5毒力基因携带情况 本研究中单增李斯特菌均携带毒力岛LIPI-1,其中全部CC3菌株(100.0%,10/10)和部分CC1菌株(80.0%,4/5)均携带毒力岛LIPI-3,全部CC87菌株(100.0%,31/31)均携带毒力岛LIPI-4。在其他已知的74个毒力基因中,有70个毒力基因的携带率较高(81.5%~100%),而inlJ(63.0%,92/146)、ami(43.2%,63/146)、inlF(38.4%,56/146)和lisk(19.9%,29/146)4个基因的携带率相对较低。其中家系Ⅰ菌株不携带inlF和lisk基因,家系Ⅲ菌株不携带inlC、inlF、ami、lapB、aut、lisR和gtcA基因(图2)。值得注意的是,家系Ⅱ中1株ST626型菌株携带毒力岛LIPI-1和LIPI-2部分片段,还包括一些非连续的伊氏李斯特菌的染色体片段,Yin Y等详细分析了该菌的高毒力的特点[27]。18株菌的内化素蛋白A(Internalin A,InlA)发生了提前终止(PMSC),食品菌株(21.6%,16/74)中InlA蛋白的提前终止率高于病人菌株(3.2%,1/31),差异具有统计学意义(χ2=5.4,P<0.05)。

基因的存在和不存在分别用蓝色和灰色表示,颜色的深度表示Identity值的大小。

2.6环境抗性基因携带情况 本研究82.5%(52/63)的家系Ⅱ菌株和22.4%(17/76)的家系Ⅰ菌株携带压力生存岛SSI-1,携带率差异具有统计学意义(χ2=49.9,P<0.01)(表2)。仅有1株ST121(家系II)菌株携带SSI-2。本研究未发现我国菌株中携带抗季胺类消毒剂基因的LGI1。2株CC1、19株CC2和3株CC14菌株均携带LGI2,该基因组岛含有抗砷(arsD1A1R1D2R2A2B1B2)和抗镉(cadA4C4)基因。另外,75.0%(15/20)的CC9菌株含有Tn554类似转座子,携带砷抗性基因簇(arsCBADR)(图1)。

3 讨 论

单增李斯特菌是一种重要的食源性致病菌,目前报道的李斯特菌病大多通过食源性传播[19],而李斯特菌病潜伏期较长,给被污染食品的溯源和食品安全监管带来一定困难。全基因组序列分析(WGS)已成为病原溯源调查和分析遗传多样性的重要方法。本研究对我国146株单增李斯特菌的全基因组进行了比较分析,描述了菌株的多样性、特异性及相关性。

本研究中相同家系、血清型和克隆群的单增李斯特菌在系统发育进化树上聚在一起,这种分布与菌株的来源和分离省份无关,提示单增李斯特菌基因组结构具有一定的稳定性。同时不同省份和分离时间的菌株在系统发育树上交叉分布,可能与单增李斯特菌污染的食品在我国不同省份间的流通有关。

研究显示大多数李斯特菌病的暴发与家系Ⅰ菌株有关,相比于家系Ⅱ菌株,家系Ⅰ菌株在临床分离菌中所占的比例高[9,28],这可能与部分家系Ⅰ菌株携带的毒力岛LIPI-3和LIPI-4导致菌株毒力增强有关[11,29]。此外,由inlA基因编码的InlA蛋白通过与宿主上皮细胞的E-钙黏素结合,使单增李斯特菌可穿过肠道屏障引起侵袭性感染[30]。研究发现部分菌株中inlA基因会发生PMSC突变,截断的InlA蛋白的功能下降或失活[31]。部分食品菌株的inlA基因发生了PMSC突变,可能导致其毒力减弱。

质粒有助于其宿主菌在不利环境下生存繁殖,如ST8型菌株携带的质粒pLMR479a有助于增强菌株对高温、高盐、酸性环境和消毒剂的耐受[32]。压力生存岛SSI-1有助于菌株在低pH和高盐浓度等不良条件下生存[13]。本研究中发现,71.43%和82.54%的家系Ⅱ菌株分别携带质粒和SSI-1,可以提高菌株的环境适应力。此外,许多与环境适应性相关的基因广泛存在于家系Ⅱ菌株中[33],如热应激相关的基因sigC、lmo0421和lstR仅存在于家系Ⅱ和家系Ⅲ菌株中[34]。ST9型(家系Ⅱ)菌株中携带类似Tn554转座子的抗砷基因簇可能有助于ST9型菌株在食品中的生长繁殖,其具体功能需进一步研究证实。因此,大部分家系Ⅱ菌株可能具有更好的环境适应性能力,从而有助于其在食品和环境中的生长繁殖。

CC9型是我国食品分离菌株的优势型别,这与其他国家的报道一致,可能与其携带的质粒和环境抗性基因有关[10]。CC87型菌株是我国李斯特菌感染病例中分离菌株的常见菌型[12],这可能与其携带的毒力岛LIPI-4有关,该毒力岛有助于单增李斯特菌穿过人的胎盘和血脑屏障,增加单增李斯特菌的感染性[29]。国外临床菌株的优势克隆群CC1、CC2和CC3型菌株同样也在我国散发的李斯特菌病病例中出现[29]。此外,其他克隆群CC5、CC7、CC8、CC9、CC14、CC29、CC89、CC155、CC429的菌株在我国临床病例中均有出现,说明不同型别单增李斯特菌对人群健康都具有潜在风险,也显示对我国食品和临床病例进行单增李斯特菌的病原学监测及分子流行病学特征分析的重要性。

据报道,携带抗砷和抗镉基因的LGI2存在于CC1、CC2和CC4型菌株中,特别是4b血清型菌株,可能有助于提高菌株的毒力[14]。本研究发现,我国浙江省、云南省和新疆地区分离的3株CC14型菌株(1/2a血清型)也携带有LGI2,提示LGI2可以在不同CC型、血清型菌株间转移。具有抵抗季胺类消毒剂功能的LGI1存在于加拿大的CC8菌株中[35],尚未在我国菌株中发现,可能与我国不同的消毒剂暴露剂量有关。本研究中菌株XYSN是Yin Y等在羊的李斯特菌病暴发事件中分离的1株高毒力的4h血清型菌株,同时携带单增李斯特菌的LIPI-1和伊氏李斯特菌的LIPI-2部分片段[27],提示除了常见的家系Ⅰ和家系Ⅱ致病菌株之外,可能还存在尚未发现的新的单增李斯特菌毒力变异株,应重视对这类菌株的识别和监测[1]。

本研究表明,我国分离的单增李斯特菌在基因组水平呈现出不同的种群特征,基因组结构相对稳定,不同来源的菌株在进化关系上差异不明显。全部菌株中均携带毒力岛LIPI-1,部分家系Ⅰ菌株携带毒力岛LIPI-3和LIPI-4,具有潜在的高致病性。家系Ⅱ菌株的质粒和环境抗性基因的携带率都较高,可能与菌株的环境适应力增强有关。食品菌株中InlA蛋白的提前终止发生率高于临床菌株,可能会降低菌株的侵袭力。同时,基因组岛LGI2在不同菌株中的分布以及4h血清型高毒力菌株出现,应在我国单增李斯特菌的监测中加以重视。

利益冲突:无

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