超高效液相色谱-串联质谱法测定小麦粉改良剂中的苯甲羟肟酸

郑 红 于文江 周传静 尹丽丽 李 珊 刘艳明

(山东省食品药品检验研究院；山东省食品药品安全检测工程技术研究中心，济南 250101)

苯甲羟肟酸是一种十分重要的选矿药剂，由于其分子的极性基团中存在着两种带孤对电子的氧原子和氮原子，而且这两种原子的距离相隔较近，因此很容易与Cu2+、Ni2+、Fe3+等金属离子形成稳定的杂环配合物[1]。但由于苯甲羟肟酸含有苯环结构及N元素，属较难降解有机物，给人类和生态环境带来了潜在的风险和危害[2-4]。

小麦粉是我国北方民众最常食用的主食之一，也是许多烘焙等加工食品的主要原料来源[5-7]。近期有舆情报道小麦粉中有添加苯甲羟肟酸非食品原料的报道，添加的方式或许是通过小麦粉改良剂加入，所以建立小麦粉改良剂中苯甲羟肟酸的测定方法至关重要。小麦粉改良剂是一些天然的或化学合成的食品添加剂，根据性能及作用可分为营养强化剂类、无机盐类、凝胶多糖类、乳化剂类、淀粉和变性淀粉类、酶制剂类、增味增色剂类、抗氧化剂类和复合添加剂类等[8-11]。综上可得，小麦粉改良剂的种类繁多，基质较复杂，对建立小麦粉改良剂中苯甲羟肟酸的测定方法带来较大挑战。目前报道的测定苯甲羟肟酸的方法比较少，何旭元等[12]提出了一种采用红外光谱溴化钾压片法测定苯甲羟肟酸工业品纯度的方法；陈远道等[13]报道了采用紫外光度法测定水溶液中的苯甲羟肟酸；余雪花[14]采用高氯酸铁作显色剂直接分光光度法测定水溶液中目标化合物的含量；周春山等[15]采用反相高效液相色谱法，对氧化铅矿浮选药剂铜铁灵和苯甲羟肟酸完成了分离和测定。近期市场监督管理局针对舆情公布的补充检验方法BJS202002，此方法采用液相色谱法测定，前处理需氮吹浓缩、仪器运行时间耗时长，灵敏度较低，对分离度要求较高，因只有保留时间及光谱图定性，若有阳性样品还需质谱确证[16]。目前文献针对苯甲羟肟酸的研究基质大多针对工业纯品或水溶液，鲜见采用液相色谱-串联质谱方法测定的报道。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

AB SCIEX Triple Quad6500超高效液相色谱-串联质谱仪(配电喷雾电离源)，色谱柱：Waters ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱(75 mm×2.1 mm，1.7 μm)，MS3型涡旋混合器；SB-800DTD超声清洗仪，Sigma 3-18K型冷冻离心机，Mili-Q超纯水机。

苯甲羟肟酸标准品(纯度98.9%)、甲醇(色谱纯)、甲酸(色谱纯)和醋酸铵(色谱纯)。

1.2 实验方法

1.2.1 标准溶液配制

准确称取苯甲羟肟酸标准品10 mg于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度线，配制成浓度为1 mg/mL的标准储备液，于-18 ℃避光保存。准确移取苯甲羟肟酸标准储备液，用甲醇稀释配制成浓度为10 μg/mL的混合标准中间液，然后用甲醇∶水(1∶1)稀释配制成浓度为5、10、20、50、100、200、500、1 000 ng/mL的系列标准工作溶液。

1.2.2 样品前处理

准确称取不同种类小麦粉改良剂2 g(精确至0.001 g)，置于50 mL具塞离心管中，准确加入10 mL甲醇，涡旋混匀1 min，超声提取15 min，9 000 r/min离心5 min，取上层有机层500 μL，加水500 μL稀释一倍，涡旋混匀后过0.22 μm有机微孔滤膜过滤后，供液相色谱-串联质谱仪测定。

1.2.3 仪器分析条件

1.2.3.1 液相色谱条件

色谱条件：色谱柱：Waters ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱(75 mm×2.1 mm，1.7 μm)；流动相A：0.1%甲酸水；流动相B：甲醇；流速：0.3 mL/min；进样体积：5 μL；柱温：40 ℃；洗脱方式：梯度洗脱见表1。

表1 超高效液相色谱-串联质谱方法流动相梯度洗脱程序

1.2.3.2 质谱条件

离子源：电喷雾电离源负离子(ESI-)；扫描方式：多反应监测；喷雾电压：5.5 kV；雾化气温度：600 ℃；雾化气压力：55 psi；辅助气压力：55 psi；碰撞气压力：8 psi；气帘气压力：35 psi。苯甲羟肟酸的质谱参数见表2。

表2 苯甲羟肟酸的质谱数、保留时间、分子式、分子量等信息

2 结果与讨论

2.1 前处理条件的优化

苯甲羟肟酸为弱酸类化合物，易溶于水及甲醇。根据相似相溶的原理，实验比较了水、甲醇/水(5∶5)、甲醇三种提取剂的回收率，对于不含淀粉或变性淀粉的小麦粉改良剂三种提取剂的回收率都在85%以上，但由于大多小麦粉改良剂中含有淀粉，前两种提取剂由于水的存在，小麦粉改良剂呈现黏稠状，导致样品无法分散，实验无法进行，只有提取剂为纯甲醇时，所有样品提取液澄清，而且回收率在90%以上，故选择甲醇为最终提取溶剂。由于超高效液相色谱中存在溶剂化效应，当直接将甲醇提取后的样品溶液注入UPLC-MS/MS检测时，由于样品溶剂(甲醇)强度远强于初始流动相溶剂(甲醇∶0.1%甲酸水=2∶98)强度，匹配性差，导致色谱峰形分叉，当将样品溶液用水稀释一倍后，峰形明显改善，而且响应值并未降低，见图1。

图1 苯甲羟肟酸以甲醇和甲醇/水为上机溶剂下的总离子流图

2.2 液相色谱质谱条件优化

本研究采用蠕动泵直接注入苯甲羟肟酸标准溶液(1 μg/mL)优化各参数。苯甲羟肟酸分子结构见图2，分子量为137，在Q1全扫描模式下失去氢生成母离子[M-H]-；然后采用Product ion 模式，通过改变碰撞能，对子离子进行扫描，图2为碰撞能30 eV下，苯甲羟肟酸的子离子扫描图，可看出苯甲羟肟酸碎片信息很丰富，主要为121、92、77、65、58的碎片离子。然后将Q1 MS模式下找到的母离子[M-H]-及Product ion 模式找到的所有碎片离子导入MRM扫描模式的列表中，对碰撞能等参数进行系统优化，发现所有碎片离子中92和58的丰度最高，而且在实际样品的测定中信号稳定且无干扰色谱峰存在，因此本实验最后选以上两个碎片作为最终的监测离子。

图2 苯甲羟肟酸的子离子扫描谱图(30 eV)

此外比较甲醇-水、甲醇-醋酸铵、甲醇-甲酸水三种流动相系统对其峰形及响应值考察，结果显示三种流动相体系下，灵敏度差异不大，但当采用甲醇-甲酸水为流动相时，苯甲羟肟酸峰形最佳，故选择甲醇-甲酸水为最终流动相体系。

2.3 基质效应

超高效液相色谱-串联质谱方法虽然具有液相优异的分离度和质谱较高的分辨力，但基质效应的存在严重影响了定量的准确性和精密度。为了考察不同种类小麦粉改良剂的基质效应，本研究采用比较阴性基质标准工作溶液和纯溶剂标准工作溶液的拟合标准曲线的斜率，进而评估小麦粉改良剂的基质效应。以公式A=Ks/Kp计算基质效应，其中Ks为含基质标准工作曲线的斜率，Kp为纯溶剂标准工作曲线的斜率，A为两斜率之比，当A≈ 1时，基质效应为0；A>1，说明有基质效应增强，A<1 说明基质效应抑制。表3为浓度为5～1 000 ng/mL线性范围内，纯溶剂及不同阴性基质匹配溶液校正曲线下的标准曲线方程、斜率及A值，发现4类小麦粉改良剂(无机盐类、淀粉和变性淀粉类、酶制剂类和复合添加剂类)的A值在0.980～1.037之间，偏差在-2%～3.7%，A≈1，基质效应可忽略，表明本方法去除基质效应能力强，免除了每类小麦粉改良剂需配制一套基质匹配校正曲线的繁琐操作。

表3 不同空白基质下苯甲羟肟酸的标准曲线方程、斜率及A值

2.4 方法的线性范围、检出限与定量限

将1.2.1配制的标准工作溶液分别注入超高效液相色谱-串联质谱仪检测，以标准工作溶液峰面积为纵坐标，以标准溶液的浓度为横坐标，权重为1/X时，绘制标准曲线，结果表明HPLC- MS/MS方法在浓度为5～1 000 ng/mL范围内，r2大于0.999，线性良好。

采用在空白小麦粉改良剂中添加目标化合物的方法，确定方法的检出限与定量限。以对应色谱峰响应值3倍信噪比的质量浓度作为方法检出限，对应色谱峰响应值10倍信噪比的质量浓度作为方法定量限，见表4。

2.5 方法回收率和精密度

采用在阴性小麦粉改良剂中添加定量限、2倍定量限、10倍定量限的目标化合物进行加标回收试验，验证方法准确度和精密度。每个浓度水平平行测定6次取平均值，计算回收率和精密度。结果见表4。阴性样品及添加水平为定量限的MRM色谱图见图3。

图3 阴性小麦粉改良剂的MRM谱图(a,b)和添加量为定量限(0.0 5 mg/kg)的小麦粉改良剂的MRM谱图(c,d)

表4 苯甲羟肟酸在UPLC-MS/MS上的检出限、定量限、线性范围、加标回收率和精密度

2.6 与标准方法比较

将本方法与BJS202002比较，见表5。发现此方法的检出限不仅比标准BJS202003降低了10倍，而且省去了氮吹浓缩的时间，减少了仪器运行的时间，大大提高了检测效率。此外质谱定性比紫外光谱定性更准确。

表5 本方法与BJS202003比较

2.7 样品测定

对市售的28个小麦粉改良剂的苯甲羟肟酸采用本方法进行测定，方法适用性好、回收率高。其中有一批次有检出，检出值为1.59 mg/kg，其谱图见图4，其他均未发现有阳性样品检出。结果表明，小麦粉改良剂中确实存在苯甲羟肟酸检出，应当引起相关监管部门及生产企业的重视，完善相关的检测及限量标准。

图4 阳性小麦粉改良剂的总离子流图

3 结论

本研究系统考察了不同提取剂对小麦粉改良剂中苯甲羟肟酸的提取效果，优化了色谱条件及质谱参数，并考察了不同种类小麦粉改良剂的基质效应，建立了小麦粉改良剂中苯甲羟肟酸的超高效液相色谱-串联质谱方法。该方法与BJS202002比较，简单、省时、灵敏度高、特异性强。此外基质效应可忽略，适用于大批量及种类繁多的小麦粉改良剂中苯甲羟肟酸的测定，提高了检验工作的工作效率；同时为建立相关标准及监管部门风险监控提供参考。