灵芝多糖对人肺癌A549细胞增殖凋亡的作用

李志强，何玉霞

（沧州市传染病医院结核三科，河北沧州 061001）

肺癌是一种在临床上比较常见的恶性肿瘤，由呼吸系统出现故障所引起，能够对患者的身体健康造成严重威胁，甚至能够威胁患者的生命安全[1,2]。据相关流行病数据表明，在我国，肺癌呈明显上升的趋势，且相比其他的恶性肿瘤，肺癌具有更高的发病率和病死率[3,4]。据临床调查显示，男性肺癌的发病率要高于女性肺癌的发病率，且长期抽烟人群的发病率要高于非抽烟人群20倍左右[5,6]。

有大量实验研究结果表明，植物多糖与临床上常用的抗癌药物相比，植物多糖对细胞毒性作用更小，更安全[7,8]。灵芝多糖能够修复人体老化细胞，能够预防疾病的发生，提高免疫能力，能对慢性疾病起到防治作用，具有非常好的食疗调节功能。灵芝多糖可制作为保健食品，灵芝多糖可添加进口服液、饮料等之中，可以丰富食品市场[9,10]。灵芝多糖能够融于热水之中，能够起到促进血液循环、提升免疫能力、糖衰老、降血糖等作用。灵芝可用于食品、化妆品等多个行业，对食品和化妆品市场进行了丰富。有学者在研究中表示，使用灵芝多糖肽对肝癌细胞进行干预，能够抑制癌细胞迁移，诱导癌细胞凋亡，但是目前关于使用灵芝多糖对肺癌进行干预的研究还相对较少。对灵芝多糖影响肺癌细胞生物学行为的作用进行观察研究，能够为肺癌的临床治疗提供新的研究方向。

Bcl-2、PI3K、Akt是临床常用的细胞凋亡蛋白，三者表达变化与癌细胞增殖、凋亡能力变化具有密切联系[11,12]。本研究设计实验，培养肺癌A549细胞，使用灵芝多糖进行干预，检测癌细胞增殖、凋亡能力变化及Bcl-2、PI3K、Akt相对表达量，探究灵芝多糖对人肺癌A549细胞的干预效果。

1 材料与方法

1.1 材料

人肺癌A549细胞株购于ATCC；主要试剂：小鼠抗大鼠PI3K抗体，BD公司；大鼠抗兔Akt抗体，上海国药集团化学试剂有限公司；小鼠抗大鼠Bcl-2抗体，Gibco公司。

1.2 方法

1.2.1 灵芝多糖制备

将灵芝放置在70 ℃的环境中对其进行干燥处理，在经过3 h处理后，粉碎后过60目筛网，取灵芝粉末50 g，使用石油醚500 mL对其进行回流2 h，之后再进行抽滤，挥干。清除蛋白质沉淀后应用丙酮、95%乙醇、无水乙醇、乙醚等洗涤至溶液无色，70 ℃环境中干燥处理得粗多糖，以蒸馏水进行溶解过滤，去除沉淀，重复洗涤后干燥，得灵芝粗多糖。

1.2.2 灵芝多糖提取物分离纯化

1.2.2.1 离子交换树脂脱色

称取适量的灵芝多糖粗提取物，配置成配成2 mg/mL的溶液，给予树脂交换加入8 g/100 mL D-201阴离子，使用75 r/min在恒温振荡器中，脱色处理2 h在40 ℃环境进行，过滤处理后，在滤液中得到脱色提取物溶液。

1.2.2.2 Sevag法除蛋白

取适量的脱色提取物溶液，加入1/3体积氯仿-正丁醇混合液（体积比为5:1），4000 r/min离心处理10 min，使用分液漏斗进行静置分层，其变性蛋白层是中间层，氯仿-正丁醇混合液是下层，对上清提取物溶液层进行收集，需要重复8次操作，包括：上清液透析、浓缩、冷冻、干燥，最后得到灵芝多糖纯化提取物。

1.2.2.3 灵芝多糖提取物纯化

称取1.0 g灵芝多糖纯化提取物，溶解于3 mL蒸馏水中，上样于平衡好的DEAE-52（OH）纤维素柱(2.5 cm×25 cm)，加入NaCl（0.075 mol/L）、NaCl（0.1 mol/L）、NaCl（0.125 mol/L）进行洗脱，其流速设置为1.0 mL/min，采用分步收集，每试管中为10 mL。之后采用苯酚-硫酸法对收集到的组分进行检测。对提取物组分进行收集，得到灵芝多糖提取物。

1.2.3 细胞培养及分组

在40 ℃的环境中对冻存的肺癌A549细胞进行火浴处理（40 ℃），之后进行充分摇晃，将摇晃均匀的肺癌A549细胞置于2 mL的培养基（10% PBS、1%双抗（青链霉素）RPMI-1640培养基500 mL）之内，之后使用2000 r/min的离心机进行离心处理，进行重悬处理后将细胞传代，使用CO2培养箱对培养基培养24 h、换液，细胞融合率达90%后传代。将本研究细胞分为空白组、药物对照组、低、中、高浓度组，种板后1 d更换培养液时加入灵芝多糖预处理，1 d后变换培养液，加入灵芝多糖，1次/d，2 d后提取细胞蛋白。空白组使用生理盐水干预，药物对照组使用2 mg/L顺铂进行干预，低浓度组、中浓度组、高浓度组细胞分别加入5、10、20 μmol/L灵芝多糖。

1.2.4 细胞毒性、增殖抑制试验

96孔板上接种细胞，将100 μL培养液加入，将其放置在37 ℃环境下对其进行培养1 d，细胞贴壁生长后分离上清液并清洗。加入各浓度灵芝多糖，并设置对照，常温下培养24 h，对上清液进行分离，每个孔使用PBS进行清洗，将50 μL亚甲基蓝着色液加入每孔中，常温下培养1 h。去除染色液后洗板，将100 μL洗脱缓冲液加入每个孔中，摇晃0.5 h后对比各组细胞区别。亚甲基蓝比色法对灵芝多糖抗细胞细胞增殖作用进行检测。

1.2.5 细胞增殖检测

MTT法检测各组细胞增殖能力。将各组细胞加入96孔板中，分别于12、24、48、72 h后再每孔中加入30 μL的MTT液，37 ℃孵育4 h，弃培养液，加入150 μL的DMSO，酶标仪在2.498 nm波长处检测每孔的OD值。

1.2.6 流式细胞仪检测细胞凋亡

常温环境中使用20 μg/mL蛋白酶K培养0.5 h后去除蛋白，使用PBS缓冲液进行彻底清洗，之后将平衡缓冲液100 μL加入其中，室温环境中平衡10 min，之后滴入TdT酶反应液100 μL，避光、室温环境中孵育1 h，之后加入100 μL SSC溶液，常温环境中静置20 min后进行清洗3次，之后使用DAPI进行复染，避光培养10 min后再次进行浸洗，封片观察。DAPI复染细胞核呈蓝色，凋亡细胞细胞核呈绿色，取每切片3视野进行观察、计算细胞凋亡率，计算平均值。

1.2.7 Bcl-2、PI3K、Akt表达检测

使用PBS缓冲液对标本冲洗之后裂解30 min，测定蛋白浓度。取20 μg/孔蛋白质，添加蛋白缓冲液后进行电泳，10 min后将电转膜置于10%的牛奶中浸泡，常温环境下封闭90 min。之后结合一抗、稀释，孵育1 d，取出后使用TBST液冲洗，结合二抗，60 min后清洗、显色。

1.3 统计学分析

2 结果与讨论

2.1 抗增殖能力和细胞毒性比较

如表1所示，灵芝多糖对肺癌A549细胞进行干预，EC25值为低浓度：247.48 mg/mL、中浓度：251.46 mg/mL、高浓度：249.54 mg/mL；EC50值分别为低浓度：309.54 mg/mL、中浓度：311.47 mg/mL、高浓度：313.39 mg/mL，未检测到细胞毒性，说明灵芝多糖抗细胞增殖能力和自身的细胞毒性无关。

表1 抗增殖能力和细胞毒性比较Table 1 Comparison of antiproliferative ability and cytotoxicity

2.2 不同浓度灵芝多糖对肺癌A549细胞增殖的影响

表2 不同浓度灵芝多糖对肺癌A549细胞增殖的影响Table 2 Effects of different concentrations of Ganoderma lucidum polysaccharides on the proliferation of lung cancer A549 cells [, %]

表2 不同浓度灵芝多糖对肺癌A549细胞增殖的影响Table 2 Effects of different concentrations of Ganoderma lucidum polysaccharides on the proliferation of lung cancer A549 cells [, %]

注：同列右肩字母不同表示差异性显著，p＜0.05，下同。

组别 增殖率/%24 h 48 h 72 h空白组 69.53±8.69a 69.18±8.76 a 68.95±8.86a药物对照组 50.63±8.11b 32.46±6.01b 26.46±4.36b低浓度组 65.34±9.24a 54.37±8.65c 50.87±7.69c中浓度组 60.42±8.74c 50.42±7.51d 36.48±5.36d高浓度组 44.37±7.48d 31.34±5.64b 20.11±2.98e

薛伟等[13]在研究中表示，对肺癌细胞进行干预，能够抑制肺癌细胞增殖。如表2所示，高浓度组细胞增殖率均低于其他组别，且空白组最高，并且时间越长，细胞增殖率均出现下降越多，空白组自73.84%下降至65.82%，药物对照组自50.63%下降至26.46%，低浓度组自65.34%下降至50.87%，中浓度组自60.42%下降36.48%，高浓度组自44.37%下降至20.11%。灵芝多糖食品有着预防肿瘤、抑制肿瘤的作用，能够软化血管、促进血液循环的作用，这一结果经过了众多学者的肯定，本文研究中使用灵芝多糖进行干预，能够对肺癌A549细胞的增殖、扩散起到抑制作用。

2.3 灵芝多糖对细胞凋亡的影响

表3 灵芝多糖对细胞凋亡的影响Table 3 Effect of Ganoderma polysaccharide on apoptosis%]

表3 灵芝多糖对细胞凋亡的影响Table 3 Effect of Ganoderma polysaccharide on apoptosis%]

组别 凋亡率/%24 h 48 h 72 h空白组 3.25±0.68a 3.31±0.59a 3.37±0.63a药物对照组 43.25±3.78b 51.34±4.38b 72.42±6.05b低浓度组 10.42±1.49c 27.86±2.62c 37.64±3.12c中浓度组 29.38±2.59d 47.43±3.47d 59.33±5.01d高浓度组 40.52±3.96b 50.16±4.65b 67.93±6.16e

有学者在研究中表示，肺癌细胞凋亡率较低，对肺癌细胞进行干预，对肺癌细胞凋亡能够起到促进的作用[14,15]。本文使用灵芝多糖对肺癌A549细胞进行干预后，结果如表3所示，高浓度组凋亡率均高于其他组别，且空白组最低，并且随着时间的推移，各组凋亡率均出现上升，药物对照组细胞凋亡率自43.25%上升至72.42%，低浓度组细胞凋亡率自10.42%上升至37.64%，中浓度组细胞凋亡率自29.38%上升至59.33%，高浓度组凋亡率自40.52%上升至67.93%。灵芝多糖食品能够提高自身免疫能力，通过提升自身免疫能力来起到抗癌和防癌的作用，本文研究中使用灵芝多糖进行干预，能够促进肺癌A549细胞凋亡。

2.4 灵芝多糖对凋亡相关蛋白Bcl-2、PI3K、Akt相对表达量

在细胞凋亡的表达中，Bcl-2、PI3K、Akt与其有着密切联系[16,17]。Bcl-2作为线粒体通路中起着调节作用的重要基因之一，有促进细胞凋亡的能力[18]。PI3K能够对信号传导、细胞形态和细胞的生理功能起到重要作用[19]。Akt作为一种靶蛋白，能够起到促使细胞生长的作用[20]。本文研究中对凋亡相关蛋白表达量进行了检测，如表4所示，各组肺癌A549细胞Bcl-2相对表达量均低于空白组，差异具有统计学意义（p＜0.05）；各组肺癌A549细胞PI3K相对表达量分别为均低于空白组，差异具有统计学意义（p＜0.05）；各组肺癌A549细胞Akt相对表达量均低于空白组。说明灵芝多糖能够调控Bcl-2、PI3K、Akt表达，从而起到促进肺癌A549细胞凋亡的作用。

表4 各组细胞Bcl-2、PI3K、Akt表达对比Table 4 Comparison of the expression of Bcl-2, PI3K and Akt in each group

图1 各组细胞Bcl-2、PI3K、Akt表达Fig.1 The expression of Bcl-2, PI3K and Akt in each group

3 结论

3.1 灵芝多糖具有一定的抗细胞增殖能力，灵芝多糖食物较为温和，能够软化血管、促进血液循环的作用，并且有预防肿瘤发生，本文研究中使用灵芝多糖干预，肺癌A549细胞增殖率出现下降，并且灵芝多糖抗细胞增殖能力和自身的细胞毒性无关。

3.2 在灵芝多糖的调控下，细胞凋亡率明显提高，且灵芝多糖的浓度和使用时间与凋亡率有密切联系，灵芝多糖能够提高自身免疫能力，通过提升自身免疫能力来起到抗癌和防癌的作用，本文研究中使用灵芝多糖对肺癌A549细胞进行调控，能够对肺癌A549细胞凋亡起到促进作用。

3.3 在灵芝多糖的干涉下，凋亡相关蛋白表达得到了调控，说明灵芝多糖能够通过对细胞凋亡相关蛋白表达的调控，起到促进细胞凋亡、抑制细胞增殖。

3.4 综上所述，灵芝多糖能够抑制细胞增殖，促进细胞凋亡，调控细胞凋亡相关蛋白的表达，说明灵芝多糖能够对人肺癌A549细胞增殖凋亡起到调控。