毛栓菌27-1漆酶对酚酸类化合物降解的效能分析

周 鑫，缪晓磊，余学军

（浙江农林大学/省部共建亚热带森林培育国家重点实验室，杭州 311300）

0 引言

雷竹(Phyllostachysviolascens)是浙江省笋用竹子主载品种，种植面积占浙江总竹林面积的10%左右，已发展了稻草、砻糠、麦麸等多种覆盖集约种植模式[1-2]，为浙江省蔬菜市场提供了价格实惠、质量优良的食用笋来源[3]。然而随着雷竹种植集约化规模的无序扩大、覆盖度的增加，超出种植容量，土壤酚酸类化合物增加，导致土壤酸化，土壤退化日益严重。据报道，富阳、临安等地部分雷竹林土壤已到达pH 4.0，全年覆盖竹林地土壤总酚酸含量约高于无覆盖竹林地1.2～3.0倍，已严重制约雷竹产业健康可持续发展[4]。毛栓菌是较有效降解木质素的微生物之一，能在纯系培养中通过分泌漆酶将木质素降解成CO2和H2O[5]。漆酶在木质素分解过程中起着重要作用，以O2为电子受体催化多酚化合物，经单电子传递形成酮及自由基的含铜蛋白酶[6]，广泛的底物特异性使其对土壤中多环芳烃(PAHs)[7]、多氯联苯[8]、苯胺类废水[9]等难降解污染物也具有催化降解作用。因此，极其有必要研究漆酶对酚酸类化合物的降解特性，以便更好地应用于雷竹林经营，促进竹产业健康持续发展。目前对漆酶的研究主要集中在高产菌株的筛选和发酵优化及漆酶对木质素的生物降解等方面[10-12]。漆酶在木质素降解[12]、有机染料的降解[13]、有机污染物的转化[8]等方面已有应用研究，也有用于连作土壤修复[14]的研究报道。笔者团队前期筛选获得了1株优良的毛栓菌菌株Trametes hirsuta27-1，发现其产漆酶能力较强且产生的漆酶具有较高的稳定性[15]。为深入了解该菌株发酵产漆酶对酚酸类化合物的降解效能，以丁香酸为酚酸类化合物的代表，采用液相色谱分析法，筛选丁香酸降解最佳条件的漆酶活性。优化漆酶活性的条件，提高漆酶对酚酸类化合物丁香酸降解效能，从而为雷竹林土壤酚酸类化合物降解的综合应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

实验采用的毛栓菌27-1属于真菌，是由李新鑫等筛选鉴定的白腐真菌，该菌株通过真菌的ITS序列测定和比对，确定为担子菌纲多孔菌科栓菌属的毛栓菌(Trameteshirsuta)[15]。该菌株漆酶活性可达94.39 U，在4℃保存，30℃恒温培养箱内培养。酚酸类化合物包括阿魏酸、香草酸、丁香酸、对羟基苯甲酸、绿原酸、龙胆酸、原儿茶酸、芥子酸、对香豆酸、咖啡酸，购自上海源叶生物科技有限公司。

实验使用的超高效液相色谱仪UPLC(1260 Infinity II Prime LC)、色谱柱 Agilengt EC-C18(2.7 μm，3.0 mm×150mm，100 MPa)由美国安捷伦公司生产。

实验于2019年10月—2020年9月在浙江农林大学省部共建亚热带森林培育国家重点实验室进行。

1.2 酶液制备

在装液量为150 mL的250 mL三角瓶中接种12.5%的种子液，在30℃的条件下，以200 r/min的转速发酵培养，发酵培养基接种培养7天后取适量的发酵液，在4℃下以8000 r/min离心10 min，取上清液为粗酶液，4℃保存。

种子培养基：马铃薯250 g，葡萄糖20 g，蛋白胨15 g，蒸馏水1 L，自然pH。

发酵培养基：葡萄糖10 g/L，酒石酸铵0.2 g/L，NH4NO30.1 g/L，麸皮8 g/L，KH2PO42 g/L，MgSO4·7H2O 0.50 g/L，CaCl21 g/L，微量元素液60 mL，醋酸-醋酸钠缓冲液(pH 4.5)0.01 mol/L。

1.3 实验方法

1.3.1 标准工作溶液的配制 分别称取适量阿魏酸、丁香酸、对羟基苯甲酸、香草酸、绿原酸、龙胆酸、原儿茶酸、芥子酸、对香豆酸和咖啡酸标准品，用80%甲醇溶解，配制成浓度均为500mg/L的母液，再用超纯水稀释，配制浓度分别为 0.01、0.1、10、20、40、100、200、500 mg/L的标准工作溶液。

1.3.2 超高效液相色谱分析

（1）色谱条件。柱温左25℃、右25℃，进样量2μL，流动相0.5%乙酸(A)-乙腈(B)，梯度洗脱(0～15min 2%～25%B；15～20 min 25%～40%B)，流速 0.6 mL/min，DAD紫外检测波长274 nm和320 nm。酚酸类化合物的检测波长及保留时间分别为香草酸274 nm、8.145 min；丁香酸274 nm、8.902 min；对羟基苯甲酸274 nm、6.735 min；原儿茶酸274 nm、4.744min；绿原酸320nm、7.533min；龙胆酸320nm、6.179min；芥子酸320 nm、12.235 min；对香豆酸320 nm、10.793 min；咖啡酸320nm、8.440min；阿魏酸320nm、12.025min。标准品色谱图见图1。

图1 10种酚酸标准样品和供式菌液处理样品色谱图

（2）线性考察。对1.3.1节配制的混合标准工作溶液，按照1.3.2节的色谱方法进行分析，以峰面积Y为横坐标、标准品进样量X为纵坐标，计算10种酚酸线性回归方程（表1）。在线性范围内，此方法进样量与峰面积线性关系良好。

表1 化合物的标准曲线、相关系数、线性范围

（3）精密度实验。精密吸取标准工作溶液，进样2μL，连续进样6次，在1.3.2（1）色谱条件下测定标准工作溶液的峰面积。10种酚酸面积的相对标准偏差(RSD)都小于0.5%，表明仪器的精密度良好。

（4）稳定性实验。精密吸取标准工作溶液，在室温环境下分别放置0、2、4、8、12、18、24 h，在1.3.2色谱条件下，记录峰面积，原儿茶酸、龙胆酸、对羟基苯甲酸、绿原酸、香草酸、咖啡酸、丁香酸、对香豆酸、阿魏酸、芥子酸峰面积的RSD分别为0.589%、0.658%、0.652%、0.851%、1.025%、0.685%、1.245%、0.689%、0.785%、1.065%，说明本实验样品在24 h内稳定性良好，可进行多次检测。

（5）重复性实验。取同一标准样品的5份，按1.3.2（1）色谱条件测定峰面积。测得10种酚酸的峰面积RSD＜5%，重复性良好。

（6）加样回收率实验。精密取同一已知酚酸含量的发酵菌酶液样品3份，每份5.0 mL，分别加入0.5、1、1.5 mL混合标准工作溶液，按1.3.2（1）色谱条件测定，记录峰面积，原儿茶酸、龙胆酸、对羟基苯甲酸、绿原酸、香草酸、咖啡酸、丁香酸、对香豆酸、阿魏酸、芥子酸的平均加样回收率分别为98.36%、104.24%、98.27%、102.79%、105.43%、101.56%、103.62%、97.24%、99.12%、102.35%，本方法准确度可靠。

1.3.3 漆酶降解酚酸类物质的效能检测 取粗酶液10 mL和定量的酚酸（浓度为10 mg/L）于50 mL锥形瓶放入30℃、200r/min恒温摇床培养降解，24 h内每隔2 h取样测定降解液中酚酸残留率[式(1)]。

式中，ct为t时刻酚酸浓度(mg/L)，c0为初始酚酸浓度(mg/L)。采用1.3.2（1）的超高效液相色谱条件分析，检测降解体系中的酚酸类化合物的变化，在UPLC测定各组分含量前，样品需要过0.45 μm微孔滤膜注入进样瓶。

1.3.4 不同降解条件下漆酶降解丁香酸的效能检测 采用0.10 mg/L HCl或NaOH调节降解液的初始pH，分别在降解液初始为pH 3、4、5、6、7的条件下，于30℃下探究不同初始pH对毛栓菌27-1漆酶降解特性的影响；在初始pH 5的条件下，设置温度分别为10、20、30、40、50℃，探究不同温度对毛栓菌27-1漆酶降解特性的影响；在初始pH 5、培养温度30℃的条件下，将降解液中丁香酸浓度设置为0.1、1、10、100、500 mg/L，探究不同初始酚酸浓度对毛栓菌27-1漆酶降解特性的影响。

催化介体可有效提高漆酶降解能力，采用不同浓度的ABTS溶液作为介体物质，在30℃、初始pH 5、香草酸浓度10mg/L的条件，设置ABTS溶液的浓度为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mmol/L，探究不同浓度介体ABTS溶液对毛栓菌27-1漆酶降解效能的影响。

式中，c1为残留酚酸浓度(mg/L)，c0为初始酚酸浓度(mg/L)。设置对照组，以灭活的酶液和同体积的超纯水重复实验。

1.3.5 漆酶活性测定 采用以2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS)为反应底物的方法测定，室温为25℃，反应体系3 mL，反应底物为2 mL的溶解于0.1 mmol/L的醋酸-醋酸钠(pH 5.0)缓冲液中的浓度为0.5 mmol/L的ABTS，加入1 mL的酶液启动反应，测定最初3 min内420 nm处的吸光值变化。定义每分钟氧化1 μmol的ABTS为一个酶活单位[ε=3.6×104L/(mol·cm)][16]。

2 结果与分析

2.1 毛栓菌27-1漆酶降解酚酸类物质的效能检测

在30℃、pH 5条件下漆酶对10种酚酸类化合物的降解效能如图2所示。毛栓菌27-1漆酶可有效降解香草酸、咖啡酸和芥子酸，3种酚酸在8 h内能被完全降解，开始的降解速率较低，2 h后对3种酚酸降解速率显著提升，6 h时咖啡酸残留率不到10%。说明毛栓菌27-1漆酶对香草酸、咖啡酸和芥子酸有良好的降解效果。

图2 毛栓菌27-1漆酶对不同酚酸底物的降解效能

毛栓菌27-1漆酶对丁香酸、阿魏酸和龙胆酸降解转化效率一般，通过12 h处理后，前两者残留率分别还有47.41%和49.67%，降解转化了近一半，而龙胆酸的降解效果较差，残留率还有68.21%。在24 h后（图2中未标注出24 h残留率），丁香酸、阿魏酸和龙胆酸的残留率分别为47.32%、48.98%、65.56%，与12 h的残留率差异不显著。

原儿茶酸、对香豆酸、对羟基苯甲酸和绿原酸在12 h和24 h的残留率分别为87.30%、96.23%、93.31%、99.84%和86.40%、96.23%、92.76%、99.65%，表现出除原儿茶酸外，毛栓菌27-1漆酶对其他3种酚酸几乎没有降解效果。说明毛栓菌27-1漆酶产生的漆酶对酚酸种类降解效能具有差异性。

2.2 不同降解条件下漆酶降解丁香酸的效能检测

根据2.1节毛栓菌27-1漆酶对10种酚酸类化合物的降解情况，以降解率居中(50%)的丁香酸为代表，进一步分析毛栓菌27-1漆酶对丁香酸降解的最优组合条件。丁香酸对生态环境有一定危害，有报道丁香酸对植物种子萌发和幼苗生长有印制作用[17]。因此，更有必要深入探究漆酶在温度、pH、初始浓度和介体ABTS溶液等外界不同条件对其的降解效能。

在30℃、自然pH条件下，对比灭活粗酶液、粗酶液和超纯水对丁香酸的降解效能（表2），可分析出漆酶是主要降解因素。

表2 不同液体对丁香酸降解效能（残留率） %

2.2.1 不同温度对漆酶降解效能的影响 从图3可以看出，在20、30、40℃条件下均有降解效果，在降解24 h后的残留率分别为70.69%、44.63%和56.48%。而在50℃时，毛栓菌27-1漆酶几乎对丁香酸没有降解效果。在低温，如10℃时24 h后丁香酸残留率87.25%，虽有一定降解效果，但效果较差。参照漆酶酶活的变化，24 h后酶活随着温度的升高而降低，推测低温虽然维持了毛栓菌27-1漆酶的活性，但不利于降解，高温会显著降低漆酶活性，抑制降解。在30℃时毛栓菌27-1漆酶表现出最优降解效果。毛栓菌27-1漆酶降解丁香酸的效能与温度的关系呈倒U曲线。

图3 不同温度对毛栓菌27-1漆酶降解效能的影响

2.2.2 不同初始pH对漆酶降解效能的影响 从图4可知，在中性和酸性下，菌株对丁香酸都有一定的降解效果。在初始pH 5时，12 h和24 h后残留率分别为47.41%、47.32%，无显著差异，表现出最好降解效果。在初始pH 3、4、6、7时，降解24 h后的残留率分别为65.56%、50.64%、75.46%、70.85%，在4 h开始表现出降解效果后，到24 h残留率都为持续下降，而pH 5时在12 h就达到最低残留率。在初始pH 3、4、5、6、7时，24 h后漆酶活性依次为78.18、81.65、80.55、77.25、75.54 U，可见初始pH对漆酶活性降低影响不大。所以该菌株在pH 5时，降解效果达到最佳。

图4 不同初始pH对毛栓菌27-1漆酶降解效能的影响

2.2.3 不同初始浓度丁香酸对漆酶降解效能的影响 从图5可知，在丁香酸初始浓度过低(0.1 mg/L)的降解条件下，未观察到明显的降解现象。在1、10、100 mg/L的丁香酸浓度条件下，毛栓菌27-1漆酶对丁香酸具有良好的降解效果，24 h后的残留率分别为43.35%、43.84%、45.54%。在1mg/L的初始浓度时，8 h后的残留率为50.64%，已有较好降解效果。而在高浓度(500 mg/L)的降解条件下，丁香酸虽然减少，但不显著，24 h后残留率仍有90.44%。在低浓度时，24 h后漆酶活性降低程度差异不大，在500 mg/L浓度时显著降低，表明高浓度酚酸会降低毛栓菌27-1漆酶的活性。所以毛栓菌27-1漆酶对较低浓度丁香酸降解效果不明显，而高浓度丁香酸对毛栓菌27-1漆酶的降解能力有抑制作用。

图5 不同初始浓度丁香酸对毛栓菌27-1漆酶降解效能的影响

2.2.4 不同浓度介体ABTS溶液对漆酶降解效能的影响 如图6所示，毛栓菌27-1漆酶对丁香酸的降解率随着ABTS溶液浓度增大而提高，在不使用ABTS溶液作为介体时，降解率只有52.68%，而在0.5 mmol/L浓度时，降解率达到100%。在无ABTS溶液时的降解率与其他各浓度条件下的降解率都存在显著差异性。表明加入ABTS介体物质后丁香酸的降解效果显著提升。

图6 不同浓度介体ABTS溶液对毛栓菌27-1降解效能的影响

3 结论与讨论

真菌漆酶的催化底物较为广泛，主要包括酚类和芳香类化合物[18]。酚酸类化合物指在一个苯环上有多个酚羟基取代的芳香羧酸类化合物[19]，由不同酚羟基取代形成不同种类。在酚酸类底物中，漆酶对于底物的降解主要产生自由基，产物不稳定，可进行二次酶催化氧化和非酶促反应，如水合、歧化和聚合[20]，进而降解去除。本实验所探究的毛栓菌27-1产生的漆酶对酚酸类化合物降解表现出差异性，其能完全降解香草酸、咖啡酸和芥子酸，不能降解香豆酸、对羟基苯甲酸和绿原酸，对其他几种酚酸类化合物降解效果不同，这可能与酚酸类物质苯环母核上的取代基不同相关，例如羧基、羟基和甲氧基等取代基类型及位置，也与毛栓菌27-1的漆酶本身特异性相关。

理化性质是影响漆酶对酚酸降解的重要因素[21]，主要包括温度、pH等。一般真菌漆酶的最适反应温度在25～50℃之间，本实验结果最适温度为30℃，虽然低温条件可较好维持粗酶液中漆酶酶活，但不利于降解反应，说明反应效果不仅由酶活高低决定。现在也有较耐高温真菌漆酶的报道，Marasmiusquercophilus漆酶[22]在75℃条件下半衰期为10 min；pH也是影响酶活性的关键因素之一，虽然多数真菌漆酶的最适反应在pH 4.0～6.0，但不同漆酶间最适pH可能不同，同一种漆酶的作用底物也有所不同，所以其最适pH存在差异。理化性质会影响毛栓菌产漆酶的能力，本实验探究降解效能运用的是粗酶液，为避免菌体的影响，后续可深入探究用菌体直接培养降解酚酸。

小分子介体存在常常对漆酶跟酚酸类化合物的聚合作用有抑制，而此时漆酶对这类化合物的降解作用则起主要作用[8]，介体可以起桥梁的作用，首先由漆酶氧化后再进行介体引导底物的氧化。常见的介体有ABTS（2,2'-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）、HBT(1-hydroxybenzotriazole)、NHA(N-hydroxyacetanilide)、3-hydroxyanthranilicacid 和 VIO(violuricacid)等[23-25]。漆酶介体体系(LMS)目前有较多研究报道，在生物燃料、绿色有机物合成、食品工业、生物传感器、生物检测等领域都有应用[26]。伴随着介质体系的深入研究，漆酶能催化底物的范围将进一步扩大，漆酶的应用领域及其价值也将得到进一步的发展和提高。本实验中利用ABTS溶液作为介体物质，可大大提高毛栓菌27-1漆酶对酚酸的降解能力。