平肝止复方免煎颗粒联合卡马西平对难治性癫大鼠海马组织自噬及凋亡的影响*

王强，薛红，郭磊磊，娄金波，李若照，刘运权

(贵州中医药大学第二临床医学院，贵阳 550000)

癫是一种常见的神经系统慢性疾病，是由大脑神经元突发性异常放电而对大脑神经功能造成障碍，严重影响患者的健康和生活质量[1]。目前已经有大量研究证实，卡马西平、苯妥英钠、苯巴比妥等临床常用抗癫药物对25%～30%癫患者治疗效果不佳[2-4]。因此，寻找针对此类难治性癫患者新的治疗方法和有效的干预药物，具有重要的现实意义。平肝止复方是本研究团队通过总结临床经验及结合前期实验研究的复方药。近年来，笔者用平肝止复方免煎颗粒联合卡马西平治疗临床确诊的难治性癫患者取得一定的疗效[5]，但其对难治性癫的治疗机制尚不明确。笔者在本研究旨在探讨平肝止复方联合卡马西平对难治性癫大鼠海马神经元的凋亡及自噬的作用。

1 材料与方法

1.1实验药物 平肝止复方免煎颗粒组成：天麻20 g(批号：1008072)，石菖蒲10 g(批号：1009044)，全蝎6 g(批号：1108023)，胆南星10 g(批号：1002036)，郁金12 g(批号：1009018)，均来自四川省新绿色药业科技发展股份有限公司，购于贵州中医药大学附属第二医院中药免煎颗粒冲剂配方。取全方药物58 g，于200 mL纯化水溶解后浓缩为0.48 g·mL-1药液，4 ℃冰箱保存备用。

1.2动物 无特定病原体(SPF)级雄性Wistar大鼠44只，体质量200～220 g，购自成都达硕实验动物有限公司，实验动物生产许可证号：SCXK(川)2015-30。大鼠于室温21～25 ℃、相对湿度40%～65%条件下饲养。

1.3试剂 苏木精-伊红(HE)染色试剂盒、尼氏染色液、BCA蛋白浓度检测试剂盒(批号：G1120、G1436、PC0020)均购自北京索莱宝生物公司；TUNEL检测试剂盒(货号：C1090)购自上海碧云天生物公司；蛋白Marker(货号：DM131-02)购自北京全式金生物技术有限公司；兔抗甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)、B淋巴细胞瘤-2(b-cell lymphoma-2，Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(bcl 2 associated X protein，Bax)、半胱氨酸蛋白酶-3(cysteinyl aspartate specific proteinase-3，Caspase-3)、自噬效应蛋白(Beclin1)、微管相关蛋白1亲链3(microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3)一抗及辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)标记羊抗兔二抗(批号：ab181602、ab196495、ab32503、ab13847、ab207612、ab192890、ab6721)均购自美国Abcam公司；海人酸(批号：K0250)购自德国Sigma公司；卡马西平，苯妥英钠(批号：S45626、S49327)均购自上海源叶生物公司。

1.4仪器 离心机(5427R)购自德国Eppendorf公司；透射电镜(Tecnai F30)购自美国FEI公司；颅脑定位仪(68526)购自天津市医疗器械研究所；石蜡切片机(RM2235)购自德国Lecia公司；光学显微镜(E200)购自日本尼康公司；超低温冰箱(DW-86L388J)购自中国海尔公司；微量移液器(3111)购自德国Eppendorf公司；电子天平(CPA26P)购自北京赛多利斯仪器系统有限公司(感量：0.1 mg)。

1.5动物造模和分组 大鼠适应性饲养7 d后开始造模[6-7]。随机选取36只大鼠麻醉后，通过脑立体定位仪于右侧海马腹后部CA3区注射1 μg·mL-1海人酸2 μL，注射完毕留置5 min后缓慢拔出注射器，注射口以钟表螺丝封口，于对应左侧颅骨定位处以牙钻钻孔并以钟表螺丝封住，两侧均用牙科水泥封口，将记录电极接在钟表螺丝上面，最后缝合头皮。假手术组大鼠于同样解剖定位下予0.9%氯化钠溶液2 μL，术后对大鼠行为学进行观察并记录。采用Racine评分法进行分级评分：I级，咀嚼、眨眼、立须等面部肌肉的抽搐；II级，以点头运动为主的颈部肌肉抽搐；Ⅲ级，单侧前肢阵挛、抽搐；Ⅳ级，双侧前肢阵挛、抽搐伴身体立起；V级，双侧后肢强直，身体背曲强直，跌倒伴全身阵挛。造模后出现Ⅳ级以上发作视为癫造模成功，未达到Ⅳ级发作归入造模不成功组弃用。待癫模型成功后，将癫大鼠以0.03 g·kg-1·d-1苯妥英钠灌胃；假手术组大鼠灌胃同体积0.9%氯化钠溶液。连续灌胃14 d后，进行行为学观察，仍有25只性发作，归为成功的难治性癫动物模型，模型成率69.4%。最后采用随机分组法进行分组，选取制备成功24只模型大鼠，分为模型对照组、卡马西平(0.03 g·kg-1·d-1)组，平肝止复方(4.8 g·kg-1·d-1)联合卡马西平(0.03 g·kg-1·d-1)组，每组8只大鼠，另加假手术组8只。造模结束后各组大鼠灌胃相应药物或0.9%氯化钠溶液，给药量通过人和大鼠体表面积比值换算，每天给药1次，给药体积10 mL·kg-1，分别给药28 d后处死大鼠，取海马组织。

1.6HE染色观察海马组织 取大鼠海马组织，于4%多聚甲醛中固定48 h，经过逐步脱水，石蜡包埋后，以厚度5 μm切片，脱蜡后苏木精染色，1%盐酸乙醇分化，伊红染色，中性树胶封片，摄像观察。

1.7尼氏染色观察海马组织 取大鼠海马组织，4%多聚甲醛固定48 h，经过逐步脱水，石蜡包埋后，以厚度5 μm均匀切片，脱蜡后1%甲苯胺蓝染色，95%乙醇快速分化，脱色，无水乙醇快速脱水，二甲苯透明，摄像观察。

1.8透射电镜观察海马组织自噬 取大鼠海马组织，于2.5%戊二醛和1%锇酸固定，乙醇和丙酮梯度脱水，环氧树脂浸透包埋，制备超薄切片，醋酸铀和柠檬酸铅分别染色5 min，透射电镜观察摄像观察。

1.9TUNEL检测海马组织凋亡 末次给药结束后，取海马组织于4%多聚甲醛中固定48 h，石蜡包埋获取组织切片，脱蜡，加蛋白酶K工作液孵育20 min，石蜡切片加入TUNEL反应液室温避光孵育60 min，加DAPI染核，封片，荧光显微镜下观察采集图像。

1.10Western blotting检测海马组织bcl-2、Bax、Caspase-3、Beclin1、LC3蛋白表达 将海马组织匀浆后加入蛋白裂解溶液于冰上裂解15 min，4 ℃下，14 000 r·min-1(有效半径8.5 cm)离心10 min，收集上清液。BCA法测定相应蛋白浓度。取等量蛋白样品以12%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)电泳分离，聚偏氟乙烯(Polyvinylidene fluoride，PVDF)转膜，5%脱脂奶粉缓冲液于室温下封闭2 h，经bcl-2、Bax、Caspase-3、Beclin1、LC3、GAPDH等一抗于4 ℃静置孵育过夜，再以相应HRP标记的二抗37 ℃摇床孵育2 h，电致化学发光(electrochemiluminescence，ECL)显影后扫描胶片，统计分析目的蛋白和内参蛋白条带光密度值，以目的蛋白与内参蛋白光密度比值作为目的蛋白的表达量。

2 结果

2.1大鼠海马组织病理变化 HE染色结果表明，假手术组大鼠海马组织结构清晰完整，神经细胞形态完整，呈圆形、椭圆形，排列有序，核仁清晰，形态正常。与假手术组比较，模型对照组大鼠神经元细胞排列紊乱，细胞间距增加，神经细胞结构不完整，细胞肿胀、破裂，轮廓模糊；与模型对照组比较，卡马西平组神经元排列尚且整齐，细胞核形态较为正常，存在部分破裂、坏死性神经元细胞；与卡马西平组比较，平肝止复方联合卡马西平组细胞排列较整齐，细胞核形态较正常，仅有散在的坏轮廓模糊的神经元。结果见图1。

2.2各组大鼠尼氏体变化 尼氏染色结果显示，与假手术组比较，模型对照组尼氏体减少，细胞排列紊乱，形状不规则。与模型对照组比较，卡马西平组尼氏体数量增加，细胞排列较为整齐。与卡马西平组比较，平肝止复方联合卡马西平组的尼氏体数量相对增加，细胞排列紧密有序。结果见图2。

2.3各组大鼠自噬 假手术组大鼠细胞质中线粒体、内质网等结构清晰，未见明显自噬体；模型对照组可见细胞核固缩、碎裂、胞膜轮廓不清、胞质疏松，与假手术组比较自噬体显著增加(F=6.476，P<0.05)；卡马西平组细胞形态结构基本正常，可见细胞质中线粒体、内质网，与模型对照组比较自噬体显著减少(F=0.682，P<0.05)；与卡马西平组比较，平肝止复方联合卡马西平组自噬体显著减少(F=1.597，P<0.05)，结果见图3。

2.4大鼠海马组织及海马神经元凋亡变化 大鼠海马组织凋亡情况见图4。与假手术组比较，模型对照组大鼠海马组织凋亡增加；与模型对照组比较，卡马西平组及平肝止复方联合卡马西平组大鼠海马组织凋亡下降；与卡马西平组比较，平肝止复方联合卡马西平组大鼠海马组织凋亡下降。

A.假手术组；B.模型对照组；C.卡马西平组；D.平肝止复方联合卡马西平组。

A.假手术组；B.模型对照组；C.卡马西平组；D.平肝止复方联合卡马西平组。

A.假手术组；B.模型对照组；C.卡马西平组；D.平肝止复方联合卡马西平组；①与假手术组比较，P<0.05；②与模型对照组比较，P<0.05；③与卡马西平组比较，P<0.05。

2.5大鼠海马组织Bax、Bcl-2、Caspase-3、Beclin1及LC3表达结果 Western blotting检测结果见图5。与假手术组比较，模型对照组大鼠海马组织Bax、Caspase-3、Beclin1、LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表达显著性增加(F=5.166，5.065，1.388，3.216，P<0.05)，Bcl-2蛋白表达显著性减少(F=0.233，P<0.05)；与模型对照组比较，卡马西平组大鼠海马组织LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表达减少(F=0.252，P<0.05)，Bcl-2蛋白表达显著性增加(F=0.004，P<0.05)，Bax、Caspase-3、Beclin1蛋白表达减少但不显著(F=1.352，0.259，0.143，P>0.05)，平肝止复方联合卡马西平组大鼠海马组织Bax、Caspase-3、Beclin1、LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表达显著性减少(F=2.001，0.079，0.628，0.765，P<0.05)，Bcl-2蛋白表达显著性增加(F=0.349，P<0.05)；与卡马西平组比较，平肝止复方联合卡马西平组大鼠海马组织Bax蛋白表达显著减少(F=0.004，P<0.05)，Bcl-2蛋白表达增加(F=0.291，P<0.05)，Caspase-3、Beclin1、LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表达减少但不显著(F=0.089，0.234，0.162，P>0.05)。

3 讨论

癫是神经系统常见的慢性病之一，目前我国癫发病率约0.5%，其中25%～30%患者通过临床常见抗癫药物系统治疗后仍得不到有效控制[8-9]。因此，探索难治性癫的发病机制，改善患者预后，寻找针对此类患者新的治疗方法和有效的干预药物，具有重要的现实意义。平肝止颗粒以天麻为君药，全蝎、胆南星、郁金为臣药，石菖蒲为佐使药。天麻熄风止痉、平惊定。尼氏体是神经细胞的特殊组成部分，能合成细胞器所需的重要蛋白质和产生递质有关的酶。当神经元细胞出现凋亡、炎性改变等病理变化时，尼氏小体的数量也会随之减少、甚至出现降解或消亡。随着疾病渐愈，尼氏体数量形态又恢复正常[10]。研究表明，难治性癫大鼠海马组织中细胞排列紊乱，细胞肿胀、破裂，尼氏体减少[11-12]。本研究采用较成熟的海人酸及苯妥英钠诱导法建立难治性癫大鼠模型[6-7]。结果显示，与难治性癫大鼠比较，平肝止复方联合卡马西平组大鼠海马神经元细胞尼氏体增加，细胞排列较整齐，细胞核形态较正常，仅有散在的轮廓模糊的神经元细胞，说明平肝止复方联合卡马西平对难治性癫大鼠海马神经元具有保护作用。

A.假手术组；B.模型对照组；C.卡马西平组；D.平肝止复方联合卡马西平组；①与假手术组比较，P<0.05；②与模型对照组比较，P<0.05；③与卡马西平组比较，P<0.05。

研究表明，Bcl-2及Bax在细胞凋亡进程中发挥了重要作用。Bax位于细胞质中，当细胞受到凋亡信号刺激，其由细胞质转位到线粒体膜上，进而导致线粒体跨膜电位下降，改变线粒体膜通透性进而使凋亡因子如Caspase-3释放增多[13]。Bcl-2是位于线粒体上的一种跨膜蛋白，能够与Bax结合形成二聚体，可稳定线粒体膜电位，抑制促凋亡因子释放从而起抗凋亡作用[14]。近年来，研究表明癫的发生过程中，海马组织Bax、Bcl-2、Caspase-3蛋白表达异常，神经元细胞凋亡严重[15-17]。本研究表明，相对于模型对照组，平肝止复方联合卡马西平组大鼠海马组织Bax、Caspase-3蛋白表达减少，Bcl-2蛋白增加，细胞凋亡明显降低，说明平肝止复方联合卡马西平可抑制海马神经元凋亡，从而保护海马神经元。

自噬即细胞的自我消化，是细胞把待降解的物质通过自噬体转运到溶酶体，在溶酶体的酸性环境以及溶酶体酶作用下使待降解产物被降解的过程[18]。正常生理条件下，自噬处于低水平，机体通过自噬降解细胞内多余、衰老或受损的蛋白及细胞器，来维持细胞内环境稳态[19]。当细胞受到饥饿、低氧和高温等影响时，自噬被激活，机体通过自噬降解胞内大分子及细胞器为细胞提供能量，促进细胞存活。另外自噬也是一把双刃剑，当细胞中自噬被过度激活后则引发细胞自噬性死亡[20]。Beclin1是哺乳动物中最早发现的自噬基因，其表达水平一定程度上反映自噬的活性[21]。LC3是自噬标志性蛋白，分为2个亚型，在细胞自噬形成过程中LC3Ⅰ被剪形成LC3Ⅱ，LC3Ⅱ定位于自噬体膜上是自噬的标志性分子。因此，在细胞自噬进程中LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值可以反映自噬被激活的程度[22-23]。本研究结果显示，模型对照组大鼠海马组织中自噬体增加，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ及Beclin1蛋白含量也增多，说明难治性癫大鼠海马组织中自噬过度激活。平肝止复方联合卡马西平组大鼠海马组织中自噬体减少，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ及Beclin1蛋白含量也降低，说明平肝止复方联合卡马西平可纠正海马组织异常自噬。与本研究类似，其他研究也表明癫大鼠海马组织自噬异常激活，抑制大鼠海马组织的过度自噬可以保护海马神经元从而减轻癫症状[24-25]。

综上所述，平肝止复方联合卡马西对难治性癫大鼠神经元有保护作用，其具体机制可能与调节神经元细胞自噬及凋亡有关，但难治性癫的发生机制较为复杂，是否还存在其他影响因素有待进一步深入研究。

A.假手术组；B.模型对照组；C.卡马西平组；D.平肝止复方联合卡马西平组；①与假手术组比较，P<0.05；②与模型对照组比较，P<0.05；③与卡马西平组比较，P<0.05。