血浆miR-107-5p、miR-210水平与脓毒症并发急性肾损伤患者肾功能、炎症指标及预后的关系*

郑源任，李云婷，冯奇桃，李诗阳，林芳崇

海南医学院第二附属医院急诊科,海南海口 570000

脓毒症是感染引起的全身炎性反应综合征，可导致危及生命的器官功能障碍，肾是最易受累器官之一，脓毒症“细胞因子风暴”可引起急性肾损伤(AKI)和死亡[1]。早期预测脓毒症并发AKI具有重要意义，微小RNA(miR)是具有基因转录、蛋白质合成调控的内源性非编码RNA，在维持体内平衡中具有重要作用，其表达异常与多种疾病的发生、发展有关。现有研究发现，miR在AKI中表达异常，对AKI诊断、预后预测具有潜在作用[2]。缺血再灌注损伤是引起AKI的主要原因，急性肾小管坏死或细胞凋亡是AKI的主要病理基础，miR-107-5p参与肾小管内皮细胞增殖、凋亡调控机制[3]。miR-210是缺血调控关键因子，参与肾脏缺血再灌注损伤过程，在AKI患者血浆中水平上调，与AKI临床分期明显相关[4]。本研究检测脓毒症患者血浆miR-107-5p、miR-210水平，探讨其与脓毒症并发AKI肾功能、炎症指标以及预后的关系，旨在为临床诊治、预后评估提供参考。

1 资料与方法

1.1一般资料 选择2015年5月至2020年3月我院重症监护病房(ICU)收治的210例脓毒症患者作为研究对象。纳入标准：(1)脓毒症诊断参考欧洲危重病医学会制订的脓毒症诊断标准[5]；(2)年龄18～70岁；(3)既往无脓毒症病史。排除标准：(1)血液系统、免疫系统疾病患者；(2)既往有肾病综合征、肾小球肾炎、肾癌等原发性肾脏疾病病史患者；(3)入住ICU后48 h内死亡者。采集患者入院24 h内的一般人口学资料(年龄、性别)、体质量指数(BMI)、基础疾病、感染部位、脓毒症分级(脓毒症、脓毒症休克[6])、床旁监护仪记录的入院24 h平均动脉压(MAP)及平均心率(HR)。其中男118例，女92例；年龄18～70岁，平均(51.03±4.02)岁；脓毒症146例，脓毒症休克64例。根据是否并发AKI将210例患者分为AKI组(86例)和NAKI组(124例)。AKI患者符合诊断标准[7]:48 h内血肌酐(Scr)升高≥26.5 μmol/L；7 d内Scr升至≥1.5倍基线值；连续6 h尿量<0.5 mL/(kg·h)；排除系统红斑狼疮、创伤、大手术后等其它因素引起的肾损伤。AKI组和NAKI组临床基本资料比较，年龄、脓毒症分级比较，差异有统计学意义(P<0.05)，而性别、BMI、基础疾病、感染部位、MAP、HR比较差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。本研究获得本院伦理委员会批准。患者家属均知情同意并签署同意书，诊疗期间保障患者隐私和安全。

1.2方法

1.2.1急性生理与慢性健康状况评价Ⅱ(APACHEⅡ)评分 APACHEⅡ评分根据患者入ICU 24 h内临床指标(体温、HR、呼吸、MAP、血氧分压、电解质、肌酐、白细胞计数、神经功能等)最差值计算[8]。

1.2.2肾功能、炎症指标及miR-107-5p、miR-210水平检测 于入院24 h内采集外周静脉血6 mL，平均分装于干燥试管和EDTA抗凝管，干燥试管标本用于检测肾功能和炎症指标，EDTA抗凝管标本用于检测血浆miR-107-5p、miR-210相对水平。血标本均以离心半径10 cm，3 000 r/min离心10 min，分离血清、血浆-80 ℃保存于超低温冰箱。采用AU400全自动生化分析仪(日本Olympus公司)检测血清尿素氮(BUN)、血肌酐(Scr)水平。采用双抗体夹心酶联免疫吸附试验在Model 550酶标仪(美国伯乐生命医学产品公司)上检测血清胱抑素C(Cys-C)、C反应蛋白(CRP)、降钙素原(PCT)水平，试剂盒购自上海蓝基生物科技有限公司。

采用实时荧光定量PCR检测miR-107-5p、miR-210水平，方法如下：取血浆标本加入Trizol(美国Invitrogen公司)充分混匀，提取总RNA，使用ND-1000紫外分光光度计(美国NanoDrop公司)检测RNA纯度和完整性，选择A260/A280比值为1.8～2.0的RNA样品，而后按照试剂盒说明加入M-MLV反转录酶(Epicentre公司)将其转录为cDNA。CFX96实时荧光定量PCR仪(美国Bio-Rad)检测miR-107-5p、miR-210水平。引物合成及序列测定由上海基康公司完成，序列如下：miR-107-5p上游引物为5′-GGAGCAGCATTGTACAGG-3′，下游引物为5′-CAGTGCGTGTCGTGGA-3′；miR-210上游引物为5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′，下游引物为5′-CTGTGCGTGTGACAGCGGCTGA-3′。以U6为内参，U6上游引物为5′-AGAGAAGATTAGCATGGACCCTG-3′，下游引物为5′-ATCCAGTGCAGGGTCCGAGG-3′。反应条件：95 ℃变性15 s，65 ℃退火20 s；75 ℃延伸15 s，共40个循环。以U6 snRNA 为内参，2-ΔΔCt计算各组的miR-107-5p、miR-210相对水平，共做3次平行试验，取平均值，其中ΔΔCtmiR-107-5p=ΔCtmiR-107-5p-ΔCtU6 snRNA，ΔΔCtmiR-210=ΔCtmiR-210-ΔCtU6 snRNA。

表1 AKI组与NAKI组临床基本资料

组别n感染部位[n(%)]泌尿系统导管相关血流感染腹腔感染其他脓毒症分级[n(%)]脓毒症脓毒症休克MAP(x±s,mm Hg)HR(x±s,次/分)AKI组8623(26.74)29(33.72)21(24.42)13(15.12)51(59.30)35(40.70)102.35±6.3593.35±7.18NAKI组12437(29.84)40(32.26)35(28.23)12(9.68)95(76.61)29(23.39)103.24±6.4292.76±7.09t/χ21.7417.1820.9930.590P0.6280.0070.3220.556

1.2.3随访 统计脓毒症并发AKI患者入院28 d内存活情况，将存活患者归为存活组，死亡患者归为死亡组。

2 结 果

2.1AKI组与NAKI组APACHEⅡ评分及miR-107-5p、miR-210、肾功能指标、炎症指标水平比较 AKI组APACHEⅡ评分，以及miR-107-5p、miR-210、BUN、Scr、Cys-C、CRP、PCT水平均高于NAKI组(P<0.05)，见表2。

表2 AKI组与NAKI组APACHEⅡ评分及miR-107-5p、miR-210、肾功能指标、炎症指标水平比较

2.2AKI组miR-107-5p、miR-210水平与肾功能指标、炎症指标相关性 AKI组miR-107-5p、miR-210水平与BUN、Scr、Cys-C、CRP、PCT呈正相关(P<0.05)，见表3。

表3 miR-107-5p、miR-210水平与肾功能指标、炎症指标的相关性

2.3不同预后脓毒症并发AKI患者的miR-107-5p、miR-210、肾功能指标、炎症指标水平比较 根据患者入院28 d内预后情况，将86例脓毒症并发AKI患者分为死亡组和存活组，其中死亡组33例(38.37%)，死亡组53例(61.63%)。死亡组的miR-107-5p、miR-210、BUN、Scr、Cys-C、CRP、PCT水平高于存活组(P<0.05)，见表4。

表4 不同预后脓毒症并发AKI患者miR-107-5p、miR-210、肾功能指标、炎症指标水平比较

2.4影响脓毒症并发AKI患者预后的因素 以脓毒症并发AKI患者28 d存活情况为因变量(赋值：0=存活，1=死亡)，以年龄、性别(赋值：0=女，1=男)、基础疾病(赋值：0=糖尿病，1=高血压，2=冠心病，3=高脂血症)、感染部位(赋值：0=泌尿系统，1=导管相关血流感染，2=腹腔感染，3=其他)、脓毒症分级(赋值：0=脓毒症，1=脓毒症休克)、MAP、HR、APACHEⅡ评分、miR-107-5p、miR-210、BUN、Scr、Cys-C、CRP、PCT为自变量，建立Cox比例危险模型。单因素Cox比例回归分析显示，BUN、Scr、Cys-C、CRP、PCT、APACHEⅡ评分、miR-107-5p、miR-210与脓毒症并发AKI患者预后有关(P<0.05)，见表5。多因素Cox比例回归分析显示，Cys-C、miR-210、miR-107-5p是脓毒症并发AKI患者死亡的危险因素(P<0.05)，见表6。

表5 影响脓毒症并发急性肾损伤患者预后的单因素Cox比例回归分析

表6 影响脓毒症并发急性肾损伤患者预后的多因素Cox比例回归分析

2.5miR-107-5p、miR-210对脓毒症并发AKI患者预后的预测效能 绘制miR-107-5p、miR-210预测脓毒症并发AKI患者预后的ROC曲线，结果显示，当miR-107-5p、miR-210的最佳临界值为6.91、7.03时，二者预测脓毒症并发AKI患者预后的AUC为0.878(95%CI：0.798～0.959)、0.814(95%CI：0.717～0.912)，灵敏度为81.82%、84.85%，特异度为84.91%、81.13%，约登指数为0.67、0.66，见图1。

图1 miR-107-5p、miR-210预测脓毒症并发AKI患者预后的ROC曲线

3 讨 论

脓毒症是一种常见的致命疾病，AKI是脓毒症最常见的并发症之一，脓毒症并发AKI的病理生理机制尚不清楚，可能与肾小管上皮细胞氧化应激、微血管功能障碍、炎性反应以及对炎症损伤的代谢反应等有关。脓毒症患者病死率与器官功能障碍有关，并发AKI可使脓毒症患者病死率增加6-8倍[9]。目前缺乏预测脓毒症患者并发AKI的灵敏度和特异度高的指标，导致AKI错过最佳诊治时机。miR主要通过与mRNA的3′-非翻译区结合来调节细胞功能，组织特异性强，半衰期长，可稳定存在于外周血液中，逐渐成为疾病诊断、预后判断的无创生物学指标[10]。

miR-107-5p是miR-107家族成员之一，在人类心脏、骨骼肌、大脑、肺、肝、肾、脾和胎盘中广泛而稳定表达，在细胞对缺血应激反应、细胞代谢、细胞周期调控、组织损伤修复中发挥重要作用[11]。既往研究显示，miR-107-5p异常表达与缺血性脑梗死[11]、肥胖[12]、肿瘤[13]和肾脏疾病的发生、发展[14]有关。本研究发现，AKI组miR-107-5p水平较NAKI组升高(P<0.05)，说明miR-107-5p可能参与了脓毒症并发AKI发病过程，这是因为感染引起的肾血流量减少是脓毒症并发AKI的主要病理基础，内皮细胞的激活在脓毒症并发AKI中起关键作用，脓毒症期间病原菌刺激内皮细胞分泌大量炎症因子，引起肾小管细胞损伤[15]。BUN、Scr、Cys-C是肾损伤诊断的重要指标，Cys-C可敏感反映肾小球滤过率。相关性分析结果显示，miR-107-5p水平与BUN、Scr、Cys-C、CRP、PCT呈正相关(r=0.619、0.535、0.785、0.542、0.553,P<0.05)，说明miR-107-5p可能在脓毒症患者炎性反应、肾损伤中发挥调控作用，参与AKI发病过程。可能的机制为miR-107-5p靶向内皮细胞中双重特异性磷酸酶7，促使纹状体细胞外信号调节激酶磷酸化，诱导肿瘤坏死因子-α分泌，进而介导肾小管上皮细胞收缩、E-钙黏蛋白分泌减少、N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶释放和肾小管细胞损伤凋亡，导致Scr水平升高，肾损伤加重[3]。miR-107-5p还可靶向核糖体蛋白S19，抑制核糖体蛋白S19表达，抑制肾小管上皮细胞增殖，促使其凋亡[16]。

miR-210是重要的缺氧诱导基因，位于人类11p15.5染色体，受缺氧调控因子(HIF)1α、HIF2α调控，缺氧转录因子核因子-κB也可与miR-210结合，诱导miR-210表达[17]。miR-210具有调控细胞周期、促使干细胞存活、抑制线粒体代谢、促使细胞分化、诱导血管生成等作用[17]。近期研究发现，miR-210在肾损伤中表达异常，参与肾脏缺血再灌注损伤过程[18]。本研究发现，miR-210在AKI组中水平明显升高，与LORENZEN等[19]报道结果一致；相关性分析结果显示，miR-210与BUN、Scr、Cys-C、CRP、PCT呈正相关(r=0.596、0.632、0.705、0.512、0.547,P<0.05)，提示miR-210参与脓毒症患者肾损伤过程。miR-210参与脓毒症并发AKI的机制可能为脓毒症患者伴随的炎性反应影响了肾脏局部血流动力学，引发肾脏缺血再灌注损伤，导致肾脏局部缺氧，刺激HIF表达，miR-210作为HIF靶基因和靶分子，在HIF过度活化下表达明显上调[18]。miR-210过表达可发挥负向调控HIF作用，通过靶向肾小管内皮细胞中HIF-1抑制因子mRNA 3′UTR，直接抑制HIF-1表达及其介导的细胞凋亡通路，进而降低肾脏缺氧性损伤[20]。

本研究发现，miR-210、miR-107-5p在脓毒症并发AKI患者死亡组中的水平高于存活组，Cox回归分析结果显示，miR-210、miR-107-5p是脓毒症并发AKI患者死亡的危险因素(OR=2.149、2.115,P<0.05)，说明miR-210、miR-107-5p水平增高可能预示着不良临床结局的发生，miR-210、miR-107-5p可以为预测脓毒症并发AKI患者的预后提供有价值的信息。ROC曲线分析miR-210、miR-107-5p预测脓毒症并发AKI患者预后的AUC为0.878(95%CI：0.798～0.959)、0.814(95%CI：0.717～0.912)，灵敏度和特异度均在80%以上，证实miR-210、miR-107-5p对脓毒症并发AKI患者的预后有预测价值，同时提示对于miR-210、miR-107-5p水平升高的脓毒症并发AKI患者应高度警惕不良临床结局的发生。LORENZEN等[19]报道miR-210是脓毒症并发AKI患者28 d死亡的独立预测因子。本研究回归分析同样显示，Cys-C与脓毒症并发AKI患者28 d生存状况有关，Cys-C是慢性肾衰竭、AKI诊断的敏感指标，可用于预测AKI患者的死亡风险[21]。

综上所述，脓毒症并发AKI患者血浆miR-107-5p、miR-210水平较未并发AKI患者明显增高，二者水平升高与肾损伤程度、炎性反应程度和不良预后相关，并有望成为脓毒症并发AKI患者预后评估的潜在生物学标志物和临床治疗的新靶点。