一测多评法同时测定五苓胶囊中8 种成分

2021-06-26 14:09苏凤芹陈秀娟吴慧炜孙铭军陈海燕
中成药 2021年6期
关键词:猪苓泽泻乙酰

苏凤芹,陈 卫,陈秀娟,吴慧炜,孙铭军,陈海燕

(1.济南市人民医院药剂科,山东 济南 271199;2.莱芜职业技术学院医学技术与护理系,山东 济南 271100;3.广西卫生职业技术学院药学系,广西 南宁 530023)

五苓胶囊由泽泻、茯苓、猪苓、肉桂、麸炒白术5 味中药加工而成,收载于2020 年版《中国药典》 一部[1],具有利尿、增强免疫、保护肝脏、抗肿瘤、抗辐射等作用,可明显降低高血压病患者动脉血压及血尿酸水平[2-3],联合培哚普利可改善临床症状[4];增强良性前列腺增生症术后膀胱逼尿肌收缩力,显著改善排尿障碍[5],减轻早期糖尿病肾病患者肾小球及肾小管损伤[6];降低前列腺癌患者血清中微小核糖核酸-141 表达[7];改善抗精神病药物引起水肿[8]等。但五苓胶囊现行质量标准[1,9]仅对方中肉桂所含桂皮醛进行定量控制,而中成药复方制剂是多种成分的集合体,按照中医配伍君臣佐使理论相互协调制约,从而达到整体临床疗效。因此,本实验采用一测多评法同时测定五苓胶囊中猪苓酮B、猪苓酮A、白术内酯Ⅲ、白术内酯Ⅰ、泽泻醇F、泽泻醇A、24-乙酰泽泻醇A、23-乙酰泽泻醇B 的含量,以期为提高该制剂质量标准、全面评价其整体质量提供依据。

1 材料

1.1 仪器 Waters 2695 型高效液相色谱仪(美国Waters 公司);Agilent 1200 型高效液相色谱仪(美国Agilent 公司);FA2004 型电子天平(德国Sartorius 公司);KQ-500E 型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。

1.2 试剂与药物 白术内酯Ⅲ(批号111978-201501,纯度 99.9%)、白术内酯Ⅰ(批号111975-201501,纯度99.9%)、23-乙酰泽泻醇B(批号111846-201705,纯度99.7%)对照品,均购自中国食品药品检定研究院;24-乙酰泽泻醇A(批号PRF8050342,纯度99.7%)、猪苓酮B(批号 PRF8070404,CAS 号 141360-89-6,纯度98.6%)、猪苓 酮A(批号PRF8081143,纯度97.3%)对照品,均购自成都普瑞法科技开发有限公司;泽泻醇F 对照品(批号CFS201701,纯度98.0%),购自武汉天植生物技术有限公司;泽泻醇A 对照品(批号15071422,纯度97.9%),购自上海同田生物技术股份有限公司。五苓胶囊(每粒装0.45 g,批号190203、190413、190604),购自江西品信药业有限公司。乙腈为色谱纯,购自天津市彪仕奇科技发展有限公司;其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 溶液制备

2.1.1 对照品溶液 精密称取猪苓酮B、猪苓酮A、白术内酯Ⅲ、白术内酯Ⅰ、泽泻醇F、泽泻醇A、24-乙酰泽泻醇A、23-乙酰泽泻醇B 对照品适量,甲醇制成各成分质量浓度分别为0.854、0.378、0.536、0.492、0.158、0.344、0.212、1.196 mg/mL 的贮备液,各精密吸取2.5 mL,甲醇定容至50 mL,即得(各成分质量浓度分别为42.7、18.9、26.8、24.6、7.9、17.2、10.6、59.8 μg/mL)。

2.1.2 供试品溶液 取胶囊10 粒,倾出内容物,研细,取约0.5 g,精密称定,精密加入25 mL甲醇,称定质量,超声提取45 min,放冷,甲醇补足减失的质量,滤过,即得。

2.1.3 阴性样品溶液 按2020 年版《中国药典》一部五苓胶囊质量标准项下的工艺处方,分别制备缺猪苓、缺白术、缺泽泻的阴性样品,按“2.1.2”项下方法制备,即得。

2.2 色谱条件及专属性试验 Agilent Polaris C18-A色谱柱(4.6 mm×250 mm,5 μm);流动相乙腈(A)-水(B),梯度洗脱(0~9.0 min,25.0%A;9.0~ 17.0 min,25.0%~ 43.0% A;17.0~29.0 min,43.0%~55.0% A;29.0~44.0 min,55.0%~78.0% A;44.0~50.0 min,78.0%~25.0%A);体积流量0.9 mL/min;柱温25 ℃;检测波长248 nm(0~17.0 min,猪苓酮B、猪苓酮A)[10]、220 nm(17.0~29.0 min,白术内酯Ⅲ、白术内酯Ⅰ)[11-13]、208 nm(29.0~50.0 min,泽泻醇F、泽泻醇A、24-乙酰泽泻醇A、23-乙酰泽泻醇B)[14-15];进样量10 μL。精密吸取“2.1.1”至“2.1.3”项下各溶液,在上述色谱条件下进样测定,结果见图1。由此可知,各成分色谱峰峰形对称,分离度均大于1.5,理论塔板数按各成分色谱峰计均不低于4 500,阴性无干扰。

图1 各成分HPLC 色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.3 方法学考察

2.3.1 线性关系考察 精密吸取“2.1.1”项下贮备液0.1、0.2、0.5、1.0、1.5、2.0 mL,甲醇稀释至20 mL,制成6 个质量浓度,在“2.2”项色谱条件下进样测定。以对照品质量浓度为横坐标(X),峰面积为纵坐标(Y)进行回归,结果见表1,可知各成分在各自范围内线性关系良好。

表1 8 种成分线性关系Tab.1 Linear relationships of eight constituents

2.3.2 精密度试验 取“2.1.1”项下对照品溶液,在“2.2”项色谱条件下进样测定6 次,测得猪苓酮B、猪苓酮A、白术内酯Ⅲ、白术内酯Ⅰ、泽泻醇F、泽泻醇A、24-乙酰泽泻醇A、23-乙酰泽泻醇B 峰面积RSD 分别为0.67%、0.95%、0.79%、0.83%、1.18%、1.01%、1.07%、0.56%,表明仪器精密度良好。

2.3.3 重复性试验 取同一批胶囊,按“2.1.2”项下方法制备6 份供试品溶液,在“2.2”项色谱条件下进样测定,测得猪苓酮B、猪苓酮A、白术内酯Ⅲ、白术内酯Ⅰ、泽泻醇F、泽泻醇A、24-乙酰泽泻醇A、23-乙酰泽泻醇B 含量RSD 分别为1.03%、1.36%、1.20%、1.17%、0.84%、1.69%、0.78%、0.99%,表明该方法重复性良好。

2.3.4 稳定性试验 取同一份供试品溶液,于0、2、4、6、12、16 h 在“2.2”项色谱条件下进样测定,测得猪苓酮B、猪苓酮A、白术内酯Ⅲ、白术内酯Ⅰ、泽泻醇F、泽泻醇A、24-乙酰泽泻醇A、23-乙酰泽泻醇B 峰面积RSD 分别为0.71%、0.92%、0.80%、0.85%、1.19%、0.98%、1.04%、0.59%,表明溶液在16 h 内稳定性良好。

2.3.5 加样回收率试验 取各成分含量已知的同一批胶囊细粉约0.25 g,精密称定,共9 份,按2020年版《中国药典》 四部要求,精密加入对照品溶液(猪苓酮B 0.496 mg/mL、猪苓酮A 0.212 mg/mL、白术内酯Ⅲ0.358 mg/mL、白术内酯Ⅰ0.284 mg/mL、泽泻醇F 0.088 mg/mL、泽泻醇A 0.192 mg/mL、24-乙酰泽泻醇A 0.116 mg/mL、23-乙酰泽泻醇B 0.684 mg/mL)0.5、1.0、1.5 mL各3 份,水平分别约为50%、100%、150%,按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液,在“2.2”项色谱条件下进样测定,计算回收率。结果,猪苓酮B、猪苓酮A、白术内酯Ⅲ、白术内酯Ⅰ、泽泻醇F、泽泻醇A、24-乙酰泽泻醇A、23-乙酰泽泻醇B 平均加样回收率(RSD)分别为100.06%(0.78%)、98.69%(0.91%)、98.93%(1.16%)、99.27%(0.97%)、96.99%(1.25%)、97.92%(1.47%)、97.73%(1.33%)、100.01%(0.65%)。

2.4 相对校正因子计算 采用多点校正法,取“2.3.1”项下不同质量浓度对照品溶液,在“2.2”项色谱条件下进样测定,以白术内酯Ⅰ为内标,计算其他7 种成分的相对校正因子f,公式为f=fk/fs=(CkAs)/(CsAk),其中Ck为其他成分含量,Ak为其他成分峰面积,Cs为内标含量,As为内标峰面积,结果见表2。

表2 各成分相对校正因子Tab.2 Relative correction factors of various constituents

2.5 耐用性考察

2.5.1 仪器、色谱柱 取“2.1.1”项下对照品溶液,在“2.2”项色谱条件下进样测定,考察Waters 2695、Agilent 1200 色谱仪,以及Agilent Polaris C18-A、Topsil C18、Eclipse XDB-C18色谱柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)对相对校正因子的影响,结果见表3,可知均无明显影响(RSD<5%)。

表3 不同仪器、色谱柱对相对校正因子的影响Tab.3 Effects of different instruments and columns on relative correction factors

2.5.2 柱温 取“2.1.1”项下对照品溶液,在“2.2”项色谱条件下进样测定,考察柱温20、22、25、28、30 ℃)对相对校正因子的影响,结果见表4,可知均无明显影响(RSD<5%)。

表4 不同柱温对相对校正因子的影响Tab.4 Effects of different column temperatures on relative correction factors

2.5.3 体积流量 取“2.1.1”项下对照品溶液,在“2.2”项色谱条件下进样测定,考察体积流量0.7、0.8、0.9、1.0、1.1 mL/min 对相对校正因子的影响,结果见表5,可知均无明显影响(RSD<5%)。

表5 不同体积流量对相对校正因子的影响Tab.5 Effects of different volumetric flow rates on relative correction factors

2.6 色谱峰定位 取“2.1.1”项下对照品溶液,在“2.2”项色谱条件下进样测定,以白术内酯Ⅰ为基准峰,采用相对保留时间法,在“2.5.1”项仪器、色谱柱下对色谱峰进行定位,结果见表6,可知均无明显差异(RSD<5.0%)。

表6 各成分相对保留时间Tab.6 Relative retention time of various constituents

2.7 样品含量测定 取3 批胶囊,按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液,每批平行3 份,在“2.2”项色谱条件下进样测定,分别采用一测多评法、外标法计算各成分含量,结果见表7,可知2 种方法无明显差异[相对平均偏差(RAD)<5.0%]。

表7 各成分含量测定结果(mg/g,n=3)Tab.7 Results of content determination of various constituents(mg/g,n=3)

3 讨论

五苓胶囊中泽泻功效利水渗湿、泄热化浊,为君药;猪苓、茯苓加强利水渗湿之功,合为臣药;白术功效健脾益气、燥湿利水,为佐药;肉桂功效补火助阳、引火归元,为使药,诸药合用,共奏温阳化气、利湿行水之功。本实验参考中药质量标志物确定原则[16-17],选取泽泻主要药效成分泽泻醇F、泽泻醇A、24-乙酰泽泻醇A、23-乙酰泽泻醇B,猪苓特征成分猪苓酮B、猪苓酮A,白术代表性成分特征成分白术内酯Ⅲ、白术内酯Ⅰ作为五苓胶囊指标成分进行检测。

本实验以猪苓酮B、猪苓酮A、白术内酯Ⅲ、白术内酯Ⅰ、泽泻醇F、泽泻醇A、24-乙酰泽泻醇A、23-乙酰泽泻醇B 的综合提取率为指标,对提取溶剂(95%乙醇[10]、甲醇[11,13]、水[12]、50%甲醇)、提取方式(加热回流提取、超声提取[10-15])、提取时间(30、45、60 min)进行考察,最终确定甲醇超声提取45 min 作为供试品溶液制备方法。

4 结论

本实验首次采用一测多评法同时测定五苓胶囊中猪苓酮B、猪苓酮A、白术内酯Ⅲ、白术内酯Ⅰ、泽泻醇F、泽泻醇A、24-乙酰泽泻醇A、23-乙酰泽泻醇B 的含量,该方法操作简便,结果准确,重复性好,有助于药品生产企业和监管部门不断完善该制剂质量控制标准,并为全面评价其内在质量、确保其临床疗效一致性提供依据。

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