胃癌组织内MACC1表达与临床病理特征的关系研究

后博， 梁爽， 嵇晓艳

胃癌是我国常见的一种恶性肿瘤疾病，其发病率高，在我国恶性肿瘤疾病谱中居首位[1]。胃癌的发病位置较多，包含胃窦、胃体及胃底等部位，且其发病初期的临床症状并不明显，确诊时疾病已经进展，导致患者错失了最佳的治疗时机，大大影响了患者的预后，因此在胃癌的初期如何有效地进行诊断，已成为临床研究的热门话题。胃癌的发生、发展过程中存在较多的分子异常表达，研究其异常表达情况对了解胃癌的发病机制、诊断及治疗方式的选择具有重要意义，如肝细胞生长因子(HGF)/肝细胞生长因子受体(c-Met)信号通路在胃癌的发生、发展中发挥着重要作用，通路激活对癌细胞的增殖、转移、侵袭起促进作用[2-3]。结肠癌转移相关基因-1(MACC1)是近年新发现的一个基因，具有促进肿瘤生长、转移的作用，MACC1还能与c-Met结合，激活HGF/c-Met信号通路。本研究通过研究胃癌组织内MACC1的表达情况，分析MACC1与胃癌患者临床病理特征的关系以及与HGF、c-Met的相关性，以期为胃癌的临床诊疗提供帮助。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取滨海县人民医院2017年9月至2019年9月收治的88例胃癌患者，其中男53例，女35例；年龄55～75岁，平均(65.27±8.54)岁。本研究经我院伦理委员会批准(批号：2017-19号)。由肿瘤科责任护士向患者及家属讲解本次研究的目的及方法，患者均自愿参与并签署知情同意书。纳入标准：①参照“中国早期胃癌筛查及内镜诊治共识意见”[4]确诊为胃癌；②年龄18～85岁。排除标准：①经评估患者生存时间<3个月；②存在免疫系统或血液系统疾病；③同时存在严重的肝肾功能异常或心脑血管疾病；④精神异常无法配合本次研究。

1.2 方法

1.2.1 免疫组化法检测胃癌组织内MACC1、HGF及c-Met表达水平 所有患者入院后均在治疗前行胃肠镜检查，取胃癌组织及癌旁正常组织各4块，用10%福尔马林固定24 h，常规石蜡包埋后制成厚3～4 μm的切片，切片脱蜡水化后参照SP免疫组化试剂盒染色说明书进行操作，以PBS代替一抗作为阴性对照，于显微镜下观察细胞染色结果。其中兔抗人MACC1多克隆抗体、兔抗人HGF多克隆抗体、兔抗人c-Met多克隆抗体均购自美国Abcam公司，SP免疫组化试剂盒、DBA试剂盒均购自北京中杉金桥生物技术公司。MACC1阳性主要定位在细胞质，少量在细胞核；HGF阳性定位在细胞质；c-Met阳性定位在细胞膜、细胞质。判定标准[5]：依据细胞染色程度(染色深浅与背景着色对比)与阳性细胞占比评分的乘积判定，染色程度分别给予0分(不着色)、1分(淡黄色)、2分(棕黄色)、3分(棕褐色)，阳性细胞占比评分分别给予0分(≤10%)、1分(11%～50%)、2分(51%～75%)、3分(>75%)，两项评分之积>3分为阳性，≤3分为阴性。比较胃癌组织及癌旁正常组织内MACC1、HGF、c-Met的阳性检出率。

1.2.2 RT-qPCR检测胃癌细胞株MKN28及MKN45中MACC1 mRNA表达水平 胃癌细胞株MKN28、MKN45均购自中国科学院上海细胞库，以Trizol提取细胞总DNA，使用分光光度计检测其浓度及纯度后，使用试剂盒将DNA反转录为cDNA，并以Primer设计MACC1引物：正向5′-CTTTTGATTCCTCCGGTGA-3′，反向5′-ACTCTGATGGGCATGTGCTG-3′，扩增片段136 bp。以β-actin为内参：正向5′-CACCAACTGG-GACGACAY-3′，反向5′-ATGTCACG-CACGATTTCC-3′，扩增片段407 bp，引物均由上海生工生物工程有限公司合成。PCR反应体系为SYBR Premix Ex TaqTM(2×)10.0 μl，MACC1正、反向引物(10 μmol/L)各0.8 μl，DNA模板2.0 μl，dH2O 6.4 μl，共20 μl；反应条件：95 ℃ 30 s、95 ℃ 5 s、55 ℃ 20 s、72 ℃ 20 s，共40个循环。所得结果以比较Ct法进行相对定量分析[6]。比较胃癌细胞株MKN28及MKN45中的MACC1 mRNA表达水平。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 胃癌组织及癌旁正常组织内MACC1、HGF、c-Met的阳性检出率比较

胃癌组织内MACC1、HGF、c-Met阳性检出率高于癌旁正常组织，差异有统计学意义(P<0.05)，见表1、图1～2。

表1 不同组织内MACC1、HGF、c-Met阳性检出率比较 [n=88，例(%)]

图1 胃癌组织内MACC1阳性(1A)、HGF阳性(1B)、c-Met阳性(1C)图像(免疫组化法 ×100)

图2 癌组织内MACC1阴性(2A)、HGF阴性(2B)、c-Met阴性(2C)图像(免疫组化法 ×100)

2.2 不同临床病理特征胃癌患者MACC1、HGF、c-Met阳性表达率比较

不同性别、年龄、肿瘤大小、肿瘤部位患者的MACC1、HGF、c-Met阳性检出率差异无统计学意义(P>0.05)；TNM分期为Ⅲ～Ⅳ期、分化程度低分化、浸润深度T3～T4、淋巴结有转移患者的MACC1、HGF、c-Met阳性检出率较高，差异有统计学意义(P<0.05)，见表2。

表2 不同临床病理特征胃癌患者的MACC1、HGF、c-Met阳性表达率比较 [例(%)]

2.3 胃癌细胞株MKN28及MKN45中MACC1 mRNA表达水平比较

胃癌细胞株MKN28中MACC1 mRNA表达水平为(3.58±0.08)，低于MKN45中MACC1 mRNA表达水平(4.48±0.12)，差异有统计学意义(t=58.540，P<0.001)。

2.4 MACC1与HGF、c-Met的相关性分析 MACC1与HGF、c-Met均呈正相关(rs=0.534、0.491，P<0.05)。

3 讨论

胃癌是一种源自胃黏膜上皮的恶性肿瘤。近年来随着人们生活方式及生活习惯的改变，该病的发病率也呈明显上升趋势，因此其诊疗工作也愈发受到临床医师及患者的关注[7-8]。胃癌的发生、发展过程中有多条信号通路参与，其中HGF/c-Met信号通路是参与胃癌发生、发展的信号通路之一，可对肿瘤的侵袭、转移进行调节。而MACC1是近年新发现的一种基因，能够激活HGF/c-Met信号通路，促进肿瘤的发生、发展。本研究以HGF/c-Met信号通路为纽带，探讨MACC1在胃癌发生、发展中的可能机制，以期为胃癌患者的诊断、治疗提供新思路。

本研究结果显示，胃癌组织内MACC1、HGF、c-Met阳性检出率显著高于癌旁正常组织，提示胃癌患者癌组织中MACC1、HGF、c-Met阳性表达水平高。姚继彬等[9]研究也发现胃癌组织内MACC1呈高表达，且阳性检出率明显高于癌旁正常组织，与本研究结果基本相符。MACC1包含有4个结构域，即SH3、ZU5及2个DD，其中SH3中具有酪氨酸残基，当DNA出现损失时，酪氨酸残基会出现磷酸化，形成级联酶促反应，促进癌细胞的分裂及转移[10-11]；HGF是一种具有多功能的细胞活性因子，具有促有丝分裂作用，能够诱导上皮细胞和成纤维细胞形成细胞离散及运动[12]；c-Met则是HGF的受体，在各种上皮细胞中均有表达，当c-Met与HGF结合后能够促使细胞增殖、分化[13-14]。同时MACC1还是HGF/c-Met信号通路的调节因子，与c-Met启动子结合后会激活HGF/c-Met信号通路，MACC1通过对c-Met的转录激活，参与HGF/c-Met信号转导通路，形成一个正反馈循环，促进肿瘤恶变、侵袭和转移，故胃癌患者癌组织内MACC1、HGF、c-Met阳性检出率高。

本研究结果显示TNM分期Ⅲ～Ⅳ期、分化程度低分化、浸润深度T3～T4、淋巴结有转移患者的MACC1、HGF、c-Met阳性检出率较高，表明MACC1、HGF、c-Met阳性与胃癌的发生、发展关系密切。TNM分期、分化程度及浸润深度是评估恶性肿瘤进展情况的重要依据，分化程度低、TNM分期高、浸润深度T3～T4往往代表肿瘤恶化、侵袭程度严重，分化程度高、TNM分期低、浸润深度T1～T2则表明肿瘤恶性程度较轻[15-16]。分析原因可能是MACC1激活HGF/c-Met信号通路后增强了HGF诱导的肿瘤侵袭和转移，促进了疾病的发生发展，进而导致肿瘤恶性程度加剧。谷光福等[17]研究证实胃癌发生后MACC1、HGF、c-Met的表达水平明显增高，还会参与到疾病的发生发展过程中，与TNM分期、分化程度及浸润深度关系密切，能够与本研究结果相互印证。

本研究还发现胃癌细胞株MKN45中MACC1 mRNA表达水平显著高于胃癌细胞株MKN28，因此筛查、重组MACC1稳定表达的胃癌细胞株或可为MACC1相关胃癌转移模型的建立以及MACC1在胃癌中的动态观察提供帮助。既往研究已证实c-Met与胃癌肝转移关系密切[18]。本研究发现MACC1与HGF、c-Met呈正相关，因此在后续的临床工作中可对癌组织内的MACC1、HGF、c-Met进行检查，或可为胃癌诊疗工作开展及胃癌新药研制提供新的靶点。

综上所述，胃癌组织内MACC1呈高表达，MACC1、HGF、c-Met阳性检出率高，MACC1、HGF、c-Met均参与到胃癌的发生、进展中，且MACC1与HGF、c-Met间关系密切，值得临床医师关注。