2,4-表油菜素内酯对盐胁迫下紫花苜蓿生理指标及根系离子积累的影响

王文静， 麻冬梅， 赵丽娟， 马巧利

(宁夏大学西北土地退化与生态系统恢复省部共建国家重点实验室培育基地/西北退化生态系统恢复与重建教育部重点实验室， 宁夏 银川 750021)

在农业生产中由于大量施用化肥、大水漫灌以及气候等因素的变化，使得全球盐碱化土壤面积不断扩增[1]。盐胁迫会导致渗透胁迫、离子毒害及离子分布不平衡，阻止植物对矿质营养的吸收和摄取、损害细胞的结构、扰乱细胞的生理代谢，严重影响植物的生长发育[2-6]。同时盐胁迫影响植物叶片的光合作用和呼吸作用，降低植物吸水性[7]，抑制根系对植物必需营养元素的吸收，造成植株营养亏缺[8]，生育期变短，最终导致作物减产[9]。由于盐碱胁迫对植物生长造成的巨大危害，寻找对盐碱胁迫具有抑制作用的物质以提高作物产量和改善盐碱地方面具体重要意义。

2，4-表油菜素内酯(2,4-Epibrassinolide，EBR)是一类对植物生长和发育具有重要影响的新激素，可促进植物体内蛋白质合成，提高植物酶活性并参与植物体其他生理过程[10-13]。张红[14]研究表明盐胁迫下玉米(ZeamaysL.)种子经EBR处理可提高发芽率和出苗整齐度；谢云灿等[15]研究表明，喷施外源EBR预处理不但可以通过提高常温和高温条件下大豆(Leguminosae)叶片的光合能力、促进干物质积累、提高产量，而且提高了籽粒中蛋白质含量、改善了籽粒品质；陆晓民等[16]研究发现，低氧胁迫下喷施EBR后黄瓜(CucumissativusLinn.)幼苗根系的线粒体抗氧化酶活性升高，超氧阴离子产生速率、过氧化氢含量、丙二醛(Malondialdehyde,MDA)含量降低，根尖细胞受损害程度降低，从而减轻了盐胁迫对植物造成的伤害；寇江涛等[17]研究表明，EBR可增强盐胁迫下紫花苜蓿(Medicagosativa)根系的活性氧清除能力，降低植物体内活性氧含量。因此，EBR在增强植株抗逆性、提高抗氧化酶活性和调节光合作用方面起着重要作用[18-19]。

苜蓿(Medicagosativa)作为优质的豆科类牧草，被誉为“牧草之王”[20]。苜蓿具有较强的耐盐性，其叶片对盐分侵害具有一定的抵抗能力，因此也是一类改善盐碱地状况的理想作物[21]。目前，国内外诸多学者主要围绕粮食类作物[8，13]、豆类作物[9]和蔬菜类作物[10，12，14]利用EBR增强植物耐盐性进行了大量研究，而针对不同激素浓度对紫花苜蓿幼苗材料的研究相对较少，且研究领域以光合特性和膜渗透调节为主，而对盐胁迫条件下植物体内关键酶活性和离子吸收分配的调节效应缺乏机理性研究。为此，本研究以紫花苜蓿‘阿迪娜’为试验材料，探究外源激素EBR对盐胁迫下苜蓿幼苗生理特性及离子分配与吸收的影响，以期为利用EBR增强苜蓿耐盐性能的生理机制提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料与处理

试验选择紫花苜蓿‘阿迪娜’为材料，该材料来自于宁夏大学种质资源库。于2019年5—9月在宁夏大学西北退化生态系统恢复与重建教育部重点实验室人工气候室(38°30′ N，106°8′ E)进行试验。苜蓿种子用0.1% HgCI2消毒8 min，然后用75%酒精消毒30 s，再用蒸馏水漂洗5～6遍，将清洗消毒之后的种子均匀铺在放好滤纸的培养皿中，并将滤纸用蒸馏水喷湿，放入人工培养箱培养至种子发芽(24～26℃)。待幼苗长至两叶一心时移至装有3L Hoagland，s营养液的水培箱进行培养，每3 d更换一次营养液。在营养液中培养30 d后开始处理。

试验设置 5个处理，分别为CK(浇灌营养液)、150 mmol·L-1NaCl(N)，150 mmol·L-1NaCl+0.3 μmol·L-1EBR(M1)、150 mmol·L-1NaCl +0.6 μmol·L-1EBR(M2)、150 mmol·L-1NaCl +1.2 μmol·L-1EBR(M3)，每个处理3个重复。连续处理7 d后测定各项指标。

1.2 指标测定

生理指标测定方法：超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD) 活性测定采用氮蓝四唑光还原法；过氧化物酶(Peroxidase,POD)活性采用愈创木酚法测定吸光值；过氧化氢酶(Catalase,CAT)活性采用紫外吸收法测定；丙二醛含量采用李合生的硫代巴比妥酸法测定；可溶性蛋白含量测定采用考马斯亮蓝染色法，具体步骤可参考赵世杰等的测定方法[22]。

无机离子含量测定：将植株的根系用去离子水润洗干净，并将水分用吸水纸吸干，采用干燥法对干物质量进行测定。将各处理的干样粉碎、研磨和过筛，根据毛美飞等[23]方法测定Na+，K+，Ca2+，Mg2+含量。

1.3 数据处理与分析

采用Excel 2010对数据进行统计分析和作图，用SPSS 18.0软件中的邓肯新复极差法进行单因素方差分析和多重比较(LSD<0.05)、相关性分析，并用不同字母标注差异显著性。

2 结果与分析

2.1 外源激素EBR对紫花苜蓿幼苗生长及表型的影响

与CK相比，150 mmol·L-1NaCl降低了紫花苜蓿生长指标，其中根长变化最明显，降幅达45.3%。M1处理各项指标变化小，与CK差异不显著。M2，M3处理根长和根粗与CK相比有所提高(表1)。由于水培条件下盐溶液中的Na+和CI-1可直接迅速侵入根系，因此在胁迫后很短的时间内苜蓿幼苗就出现萎蔫现象，但在喷施不同浓度的外源激素EBR 2～3 h后，幼苗茎叶萎蔫现象缓解，逐渐恢复到盐胁迫前的表型(图1)。说明就表型特征而言，外源激素EBR对盐胁迫的危害具有一定缓解作用。

表1 外源激素EBR对盐胁迫下苜蓿幼苗生长的影响Table 1 Effects of exogenous EBR on the growth of Alfalfa seedlings under salt stress

图1 外源激素EBR对盐胁迫下苜蓿幼苗表型的影响Fig.1 Effect of exogenous hormone EBR on alfalfa seedling phenotype under Salt Stress

2.2 外源激素EBR对NaCI胁迫下苜蓿幼苗叶片抗氧化酶活性的影响

由图2可知，盐胁迫会大幅度降低苜蓿幼苗叶片的抗氧化酶活性。叶片中SOD，POD，CAT活性随着EBR浓度的升高出现下降—上升—下降的趋势，并最终低于对照。与150 mmol·L-1NaCl胁迫相比，M1，M2和M3处理时苜蓿幼苗的抗氧化酶活性均升高，且M2处理下升高趋势达显著性差异，说明外源激素EBR浓度为0.6 μmol·L-1时可以显著提高紫花苜蓿幼苗的抗氧化酶活性，减轻盐胁迫对苜蓿幼苗生长的影响。

图2 外源激素EBR对NaCI胁迫下苜蓿幼苗叶片抗氧化酶活性的影响Fig.2 Effect of exogenous hormone EBR on antioxidant enzyme activity of alfalfa seedlings under NaCl stress

2.3 外源激素EBR对NaCI胁迫下苜蓿幼苗叶片丙二醛含量及电解质渗透率的影响

由图3可知，150 mmol·L-1NaCl胁迫处理下，苜蓿幼苗叶片中的电解质渗透率和MDA含量升高，显著高于对照(P<0.05)。盐胁迫下添加0.6 μmol·L-1外源激素EBR显著降低了NaCl胁迫导致的电解质渗透和MDA积累。丙二醛含量越高，对膜和细胞造成的伤害越大，说明外源激素EBR可以减少盐胁迫对植物细胞过氧化的危害，提高植株对逆境胁迫的适应性。

图3 外源激素EBR对NaCI胁迫下苜蓿幼苗叶片丙二醛含量及电解质渗透率的影响Fig.3 Effects of exogenous hormone EBR on MDA content and electrolyte permeability of alfalfa seedling leaves under NaCI Stress

2.4 外源激素EBR对NaCI胁迫下苜蓿幼苗叶片可溶性蛋白含量的影响

由图4可知，与对照相比，盐胁迫处理下苜蓿幼苗的可溶性蛋白含量显著下降(P<0.05)；盐胁迫时喷施不同浓度外源激素EBR后，幼苗叶片可溶性蛋白质含量均有提高，M2处理上升趋势最明显，但含量均低于没有盐胁迫影响。说明盐胁迫使苜蓿幼苗体内的可溶性蛋白含量降低，影响植物体内氮素的形成和正常的渗透势过程，破坏可溶性蛋白对植物细胞和生物膜的保护作用，而适当浓度(0.6 μmol·L-1)的外源激素EBR可以抑制盐胁迫的部分影响。

图4 不同处理下可溶性蛋白含量变化Fig.4 Changes of soluble protein content under different treatments

2.5 外源激素EBR对盐胁迫下苜蓿幼苗无机离子含量的影响

150 mmol·L-1NaCl处理下苜蓿幼苗根系中的Na+含量显著升高，K+，Ca2+和Mg2+含量显著降低(P<0.05)(图5)。和CK相比，NaCl处理苜蓿幼苗叶片中的Na+含量提高了32.8%(P<0.05)，K+，Ca2+，Mg2+含量分别降低了57.1%，69.7%和19.2%。由图5可知，M1处理Na+含量与对照相比上升，与盐胁迫处理相比含量下降；M1处理K+含量较对照下降了22.8%(P<0.05)，比盐胁迫处理略有上升；M1处理Ca2+和Mg2+含量均低于CK处理，但高于盐胁迫处理，分别提高了30.7%和29.1%。M2处理苜蓿幼苗根系的Na+含量显著低于NaCl处理的Na+离子含量，K+，Ca2+和Mg2+含量均远远高于NaCl处理，分别提高53.8%，66.7%，31.2%(P<0.05)。M3处理其离子含量变化趋势同M2，Na+含量低于盐胁迫处理，K+,Ca2+和Mg2+含量均高于盐胁迫。综上所述，150 mmol·L-1NaCl使植物体内K+，Ca2+和Mg2+等阳离子含量下降，喷施外源激素EBR可以有效减小盐胁迫的危害并且控制植物体内离子平衡和对植株根系生长的影响以及根系对水分和营养物质的正常吸收促进，0.6 μmol·L-1EBR为紫花苜蓿较为适应的激素浓度。

3 讨论

在我国南北方许多地区存在大量盐碱地，对各类植物造成危害，不同基因型植物对盐害的适应能力不同[26]。有大量研究报道，土壤中的含盐量在超过0.2%～0.25% 时就会对敏盐植株正常生长造成危害，耐盐植物可忍受盐分浓度为0.5%～1.8%。在我国西北地区、华北地区、东北部分和海滨等地分布有大量盐碱地，总面积大约(2～7)×107ha[27]。盐胁迫条件下，敏盐种子的萌发受到抑制，同时植株的发芽率、干鲜重等显著降低。寇江涛[17]、王小山[18]等研究表明，外源激素EBR可以缓解盐胁迫对植株生长造成的影响。本试验中，施加微量外源激素EBR便可提高紫花苜蓿幼苗中的抗氧化酶活性，使植株的可溶性蛋白含量增加，而对苜蓿幼苗的丙二醛含量和电解质渗透率具有一定的抑制作用，抗氧化酶可以有效地清除膜质过氧化物对植物造成的伤害，其活性越高，植物对逆境的适应能力越强[19]，因此外源激素EBR可在一定程度上缓解膜脂过氧化对苜蓿幼苗造成的伤害，增强植物对逆境胁迫的抵抗能力，减轻盐胁迫对苜蓿幼苗生长的影响，这一结论也与梁超[24]、邹琦[25]等的研究结果相似。相对而言盐溶液明显抑制抗氧化酶活性，提高丙二醛含量和电解质渗透率，这也和前人的研究结果相似[14-18]。由此可知，适量浓度的外源激素EBR对盐胁迫的抑制作用明显，可加强植物的耐盐性，对盐胁迫生态系统的改善具有很好的效果。

在对离子的研究方面，K+影响着植物体的水分和光合利用,淀粉以及蛋白质合成，是构成细胞渗透势的主要离子[28]，其浓度高低对气孔的开闭有调节作用。Ca2+调节植物体的许多生理代谢过程，在植物的信号传导过程中充当第二信使[29]，能够提高植物对逆境的适应性。Mg2+与植物的光合作用密切相关，是组成叶绿素的重要分子，确保光合磷酸化的正常进行[30]。本试验中，NaCl胁迫下紫花苜蓿根中的K+，Ca2+，Mg2+含量显著下降，Na+含量显著升高，表明浓度较高的Na+对K+，Ca2+，Mg2+3者的吸收有抑制作用，打破了植物体内的正常离子含量和离子分布；较低浓度的外源激素EBR (0.6 μmol·L-1)可以降低植株体内的Na+含量，提高植株体内其他离子含量，维持离子平衡。以上结果可能是由于外源激素EBR提高了NaCl胁迫下植物的根系活力和光合能力[31]，同时外源激素EBR可以调控植物根系中内源植物激素的合成[32]，从而有效调控无机离子的吸收、运输和分配，减少盐胁迫危害。

4 结论

极低浓度的外源激素EBR可以有效地减轻盐胁迫的危害，使植物体内的超氧化物歧化酶、过氧化物酶、过氧化氢酶活性升高，叶绿素含量和可溶性蛋白含量增加，丙二醛含量以及电解质渗透率下降；并且外源激素EBR可有效抑制Na+对K+，Ca2+,Mg2+的毒害，控制离子平衡；0.6 μmol·L-1EBR为紫花苜蓿受盐胁迫较为适应的激素浓度。不同物种在逆境条件下对外源激素EBR的适应程度有差异，EBR可以快速有效地影响苜蓿等一些牧草生长，对提高盐碱地牧草对逆境的耐受力，提高产量，改善生长状况具有重要意义。