MTT 法和琼脂扩散法在壳聚糖创伤敷料细胞毒性试验中的应用

刁立琴，高保栓，韩婷，王亚茹

河北省药品医疗器械检验研究院 （河北石家庄 050227）

壳聚糖是一种天然的碱性多糖，具有抗菌、止血、促进伤口愈合等生物活性[1]。羧甲基壳聚糖则是一种水溶性的壳聚糖衍生物，由其冷冻干燥而成的壳聚糖创伤敷料是一种新型的创伤敷料，目前被广泛应用于外科创面的治疗中。近年来，随着对壳聚糖研究热度的增加，市场上出现了一些壳聚糖类产品，但由于产品制备方法和生产工艺的不同，导致其具备不同的特性。因此，如何对各类产品进行科学的生物学评价是目前面临的一个重要问题。

细胞毒性试验是一种体外试验，具有周期短、敏感度高、可以快速批量筛选样品的特点，常作为生物学评价的首选项目。本研究采用MTT 法和琼脂扩散法进行壳聚糖创伤敷料的体外细胞毒性试验，探讨该类产品细胞毒性试验方法的适用性，现报道如下。

1 材料和方法

1.1 试验材料

试验样品为壳聚糖创伤敷料（由羧甲基壳聚糖冷冻干燥而成，来自生产企业送样）；细胞为小鼠成纤维细胞L-929（中国科学院上海生命科学院细胞资源中心）；主要试剂包括 MEM培养基（赛默飞世尔科技有限公司），胎牛血清（Biological Industries Israel Beit Haemek Ltd），DMSO（赛默飞世尔科技有限公司），异丙醇（天津市百世化工有限公司），ZDBC的聚氨酯膜（Hatano Research Institute，FDSC），高密度聚乙烯膜（Hatano Research Institute，FDSC），0.9%氯化钠注射液（石家庄四药有限公司），MTT（Sigma）。

1.2 方法

1.2.1 MTT 法

试验液的制备如下。（1）样品浸提液：根据GB/T 16886.12-2017《医疗器械生物学评价 第12部分：样品制备与参照材料 》中的要求，浸提比例选择6 cm2/ml，加入含10%胎牛血清的MEM 培养液，37 ℃浸提24 h，作为样品原液，并用空白对照液倍比稀释制备样品1/2、1/4、1/8组。（2）空白对照液：同批含10%胎牛血清的MEM 培养液。（3）阴性对照液：高密度聚乙烯膜按3 cm2/ml 的比例加入含10%胎牛血清的MEM 培养液，37 ℃浸提24 h。（4）阳性对照液：10%的DMSO。

试验方法依据GB/T 16886.5-2017《医疗器械生物学评价 第5部分：体外细胞毒性试验》[2]进行：将1×105/ml 细胞悬液接种于96孔板，每孔100 μl，37 ℃孵育24 h 后，去掉原培养液；分别加入样品或空白、阴性、阳性对照液，每孔100 μl，37 ℃孵育24 h；去掉原培养液，每孔加入50 μl 浓度为1 mg/ml 的MTT 溶液，继续培养2 h 后吸出孔内溶液，加入100 μl 异丙醇，振荡10 min，在酶标仪570、650 nm 双波长下测定光密度（optical density，OD）值。

细胞存活率（relative growth rate，RGR）的计算及评价：RGR（%）=（100×OD570e）/OD570b，其中OD570e为样品组或阴性、阳性对照组的光密度平均值，OD570b为空白对照组光密度平均值；RGR＜空白对照组的70%，表明具有潜在细胞毒性。

1.2.2 琼脂扩散法

试验液的制备如下。（1）样品浸提液：同MTT 法，取浸提原液和1/8组进行试验。（2）阴性对照液：0.9%氯化钠注射液。（3）阳性对照液：10%的DMSO。

试验方法依据YY/T 0127.9-2009《口腔医疗器械生物学评价 第2单元： 试验方法 细胞毒性试验：琼脂扩散法及滤膜扩散法》[3]进行：均匀接种2.5×105/ml 细胞悬液于直径为90 mm 的培养皿中，每皿10 ml，37 ℃孵育24 h；将已灭菌的3%琼脂培养基加热至48 ℃孵育，与预热至48 ℃的2倍MEM 培养基1∶1混合；吸出每个平皿中的培养液，分别加入10 ml 新鲜的琼脂培养基，室温下放置凝固后，每皿加入10 ml 中性红染色液，在暗处放置20 min 后，去掉多余的染液；吸取0.01 ml 浸提液加至直径为5 mm 的圆形滤纸片上，将滤纸片贴在琼脂表面上，同时做阴性、阳性对照；将培养皿于37 ℃孵育24 h 后，在倒置显微镜下观察，记录每一样品周围及下方的细胞反应区域是否有褪色和溶解现象，并评价细胞毒性反应级别，评价方法见表1。

表1 细胞毒性反应分级（琼脂扩散法）

2 结果

2.1 MTT 法结果

MTT 法结果显示，样品原液组和1/2、1/4、1/8组的RGR 分别为59%、71%、87%、90%，见表2。

表2 MTT 法结果

2.2 琼脂扩散法结果

孵育24 h 后，在倒置显微镜下观察，阴性对照周围及下方未观察到反应区域，毒性分级为0级；阳性对照周围及下方反应区域超出样品＞1.0 cm，细胞溶解率＞80%，毒性分级为4级；样品原液组反应区域距样品边缘＞0.5 cm 但＜1.0 cm，细胞溶解率＞50%但＜80%，毒性分级为3级；样品1/8组反应区域仅局限在样品下方，细胞溶解度＜10%，毒性分级为2级。试验结果见表3。

表3 琼脂扩散法结果

3 讨论

GB/T 16886.5-2017中规定，评价医疗器械细胞毒性时按体外细胞毒性试验进行，试验方法包括浸提液试验、直接接触试验和间接接触试验三类，其中浸提液试验中的MTT 法最为常用。MTT 法可通过代谢活性定量测定RGR，也更适合医疗器械产品中固体类产品的检验。壳聚糖创伤敷料可以很好地溶解于浸提介质中，现行标准并未对于此类可溶性产品规定具体的检测方法，需要试验者进行选择。

琼脂扩散法是一种定性评价细胞毒性的方法，也是一种长期被广泛应用的标准试验方法，该方法不适用于不能通过琼脂扩散或可能与琼脂相互作用的物质。本研究结果显示，壳聚糖创伤敷料可以采用该方法进行毒性分级评价，且壳聚糖创伤敷料的临床应用为直接外敷，采用琼脂扩散法更贴近实际应用情况；但琼脂扩散法的结果受试验者主观影响较大，可同时采用MTT 法进行定量检验，以避免单一方法的弊端。

不同的细胞毒性试验方法具有不同的评判标准，所反映的细胞毒性大小和灵敏度也会有所差别[4]。刘永帅[5]在测试葡聚糖磁性纳米材料的细胞毒性时指出，采用MTT 法进行试验出现了假阴性结果，过高地评价了细胞毒性。刁立琴等[6]的研究结果表明，MTT 法试验中，浸提液制备方法不同，得到的细胞毒性评价结果存在显著差异。本研究采用MTT 法联合琼脂扩散法对壳聚糖创伤敷料进行细胞毒性试验，发现样品原液组、1/8组两种浸提浓度的细胞毒性结果一致，更全面地评价了该敷料的细胞毒性结果。

综上所述，采用MTT 法和琼脂扩散法进行壳聚糖创伤敷料的细胞毒性试验，样品原液组和1/8组的细胞毒性结果一致，两种方法联合应用可避免单一方法得出过高或过低的评价结果。