INHBA在急性髓系白血病中的表达及功能预测

斯婷　　陆滢　　唐善浩　　裴仁治

[摘要] 目的 分析抑制素β-A（INHBA）在急性髓系白血病（AML）中的表达，并应用生物信息学技术探索及预测INHBA在AML中的生物学功能。 方法 收集2015年1月至2018年12月我院连续收治的AML患者骨髓标本120例及来源于造血干细胞移植供者的健康成人骨髓标本15例，采用细胞免疫组化、Western Blot、qRT-PCR等方法检测INHBA在AML不同细胞系及AML患者与正常成人中的表达水平;利用STRING数据库及KEGG富集分析构建INHBA蛋白质相互作用网络并预测其功能。 结果 INHBA在AML细胞系（Kasumi-1、KG-1及THP-1）中均有表达;qRT-PCR验证了INHBA在AML中的表达水平均值高于正常对照（0.718 vs 0.377），差异无统计学意义（P=0.286）;蛋白质网络互作分析显示，与INHBA互作得分在0.90 以上的17个蛋白，从高到低分别为FSTL3、ACVR2A、ACVR2B、ACVR1B、ACVR1C、ACVR1、ACVRL1、INHA、ENG、SMAD2、SMAD3、INHBB、SMAD4、IGSF1、FSHB、CGA、FKBP1A;KEGG富集分析显示，INHBA及其互作蛋白主要功能富集于TGF-β信号通路与BMP/Smad信号通路。结论 INHBA在AML中高表达，可能通过调控TGF-β与BMP/Smad信号通路参与肿瘤的发生发展。

[关键词] INHBA;急性髓系白血病;功能预测;生物信息

[中图分类号] R551          [文献标識码] A          [文章编号] 1673-9701（2021）09-0044-04

Expression and function prediction of INHBA in acute myeloid leukemia

SI Ting   LU Ying   TANG Shanhao   PEI Renzhi

Department of Hematology， the Affiliated People's Hospital of Ningbo University， Ningbo   315040， China

[Abstract] Objective To analyze the expression of inhibin β-A （INHBA） in acute myeloid leukemia（AML）， and to explore and predict the biological function of INHBA in AML by applying bioinformatics technology. Methods A total of 120 bone marrow specimens from AML patients in our hospital from January 2015 to December 2018，and 15 healthy adult bone marrow specimens from hematopoietic stem cell transplantation donors were selected. The expression level of INHBA in different AML cell lines， AML patients， and normal adults were detected by cellular immunohistochemistry，Western Blot，and qRT-PCR. STRING database and KEGG enrichment analysis were used to construct INHBA protein interaction network and predict its function. Results INHBA was expressed in AML cell lines（Kasumi-1， KG-1， and THP-1）. The expression level of INHBA in AML was higher than that of the normal control verified by qRT-PCR （0.718 vs 0.377）. The difference between the two groups was no statistically significant（P=0.286）. Protein network interaction analysis showed that 17 proteins with an interaction score above 0.90 with INHBA， from high to low， were FSTL3， ACVR2A， ACVR2B， ACVR1B， ACVR1C， ACVR1， ACVRL1， INHA， ENG， SMAD2， SMAD3， INHBB， SMAD4， IGSF1， FSHB， CGA， FKBP1A. KEGG enrichment analysis showed that the main functions of INHBA and its interacting proteins were enriched in the TGF-β signaling pathway and BMP/Smad signaling pathway. Conclusion INHBA is highly expressed in AML， which may be involved in the occurrence and development of tumors by regulating TGF-β and BMP/Smad signaling pathways.

[Key words] INHBA; Acute myeloid leukemia; Function prediction; Biological information

抑制素β-A（Inhibinβ-A，INHBA）是转化生长因子β（Transforming growth factor β， TGF-β）超家族的一个配体[1]，多项研究发现，INHBA在肺腺癌、食管鳞状细胞癌、胃癌、结肠癌、膀胱上皮癌等肿瘤组织中高表达，且其高表达与患者预后不良相关[2-6]，提示INHBA在肿瘤的发生发展及演进中具有重要意义。本研究团队在前期研究检测了初发急性髓系白血病（Acute myeloid leukemia，AML）患者骨髓单个核细胞（Mononuclear cells，MNCs）中INHBA基因的表达水平，结果显示首次发现INHBA高表达的患者治疗反应差、总体生存率低，INHBA高表达是AML患者预后不良的独立危险因素[7]。但目前INHBA在AML中的作用机制尚未揭示，其可能生物学功能尚未明确。因此，本研究将进一步研究INHBA在AML中蛋白及基因水平上的表达，且进一步用生物信息学方法预测INHBA在AML中的生物学功能，为探讨INHBA在AML中的作用机制提供理论依据，现报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料

选取2015年1月至 2018年12月于宁波大学医学院附属鄞州人民医院收治的120例初诊未治疗的AML患者。诊断均符合 WHO（2008）MICM分型诊断标准[8]，且除外急性早幼粒细胞白血病患者，所有初诊患者在诊断时留取骨髓标本5 mL。另外留取15例行异基因造血干细胞移植的健康供者骨髓标本作为对照组，随后用Ficoll密度梯度离心法分离骨髓MNCs。以上所有患者均签署知情同意书，并获宁波大学医学院附属鄞州人民医院医学临床伦理委员会批准备案。

1.2试剂及仪器

INHBA单克隆抗体、羊抗鼠二抗购于美国Santa Cruz Biotechnology公司，DAB试剂盒购于北京中杉金桥公司，Trizol试剂购于上海Invitrogen公司，RevertAid cDNA Synthesis Kit试剂购于上海Thermo Scientific公司，PCR仪LightCycler 480Ⅱ购于上海罗氏公司。

1.3 免疫组织化学

分析INHBA在AML患者及正常成人骨髓MNCs中的蛋白表达水平，参照Tan等[9]在研究中所用的免疫组织化学实验方法。将Ficoll分离所得MNCs涂片于载玻片上，在10%中性缓冲福尔马林溶液中固定1 min后，用浓度为1∶100的一抗INHBA孵育，随后用PBS洗涤，继续用带生物标记的二抗孵育后用DAB IHC 检测试剂盒显色，显色后图像使用奥林巴斯显微镜观察获取。抗体阳性判断标准：INHBA蛋白阳性表达定位于细胞胞质内，以>20%的细胞染色为棕黄色判定为阳性。

1.4 蛋白免疫印迹（Western Blot）实验

检测INHBA在AML细胞系（Kasumi-1、KG-1及THP-1）中的表达，以β-actin作为内参。收集处于指数增长期的AML细胞，加入蛋白裂解液抽提离心提取总蛋白，BCA法测定总蛋白水平，等量上样后经SDS-PAGE转移至硝酸纤维素膜，用鼠抗人INHBA单克隆抗体（孵育浓度1∶1000）进行Western Blot杂交，化学发光试剂检测目的条带。

1.5 实时定量荧光PCR（qRT-PCR）实验

用Trizol试剂从骨髓MNCs中提取总RNA，用RevertAid cDNA Synthesis Kit試剂盒进行逆转录合成cDNA，以cDNA为模板扩增INHBA基因，INHBA cDNA的正向引物和反向引物分别为5-CATTG CTCCCTCTGGCTATCAT-3，5-GCACACAGCACGAT TTGAGGTT-3。以TBP基因作为内参物。使用SYBR Green PCR Master Mix在LightCycler 480Ⅱ系统上进行。

1.6 统计学方法

采用SPSS 18.0 统计学软件进行数据分析。符合正态分布的组间均数比较采用t检验，非正态分布采用Kruskal-Wallis H检验，两组及两组以上率的比较采用χ2检验和Fisher确切概率检验。P<0.05 为差异有统计学意义。

1.7 STRING蛋白网络分析（https：//string-db. org/）

应用生物信息学在线分析工具STRING分析INHBA 的上下游调控蛋白及其与蛋白间的相关作用关系。检索条件：①Protein Name：INHBA; ②Organism：Homo-sapiens。并对INHBA进行KEGG 分析，得到功能富集分析和信号通路分析数据。校正 P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 INHBA在AML不同细胞系中的表达

在AML的三个不同细胞系（Kasumi-1、KG-1及THP-1）中，采用免疫组化及Western Blot的方法检测INHBA蛋白的表达，结果显示，INHBA在上述三个细胞系中均有较高的表达，且免疫组化结果在光镜下显示，INHBA蛋白表达定位于AML细胞的胞质内（封三图6）。免疫组化结果与Western Blot结果具有一致性。

2.2 INHBA在AML患者及正常成人骨髓MNCs中的表达

收集120例成人初发AML患者骨髓MNCs及15例正常成人骨髓MNCs，qRT-PCR检测INHBA基因的表达水平，结果显示，在AML患者中其表达水平高于对照组，两组INHBA基因平均拷贝数分别为0.718、0.377，但其差异无统计学意义（P=0.286）。

2.3 INHBA在细胞中的功能预测

利用STING 网站进行INHBA的蛋白互作分析，得到相应的蛋白互作关系网络图（图2A），相互作用节点数共有21个，筛出与INHBA具有较高互作作用的蛋白，互作得分在0.90 以上的17个蛋白，从高到低分别是FSTL3、ACVR2A、ACVR2B、ACVR1B、ACVR1C、ACVR1、ACVRL1、INHA、ENG、SMAD2、SMAD3、INHBB、SMAD4、IGSF1、FSHB、CGA、FKBP1A（图2B）。其中SMAD2、SMAD3、SMAD4属于SMAD蛋白超家族，SMAD4蛋白是BMP/Smad通路中的关键信号转导因子。

此外，进一步通过KEGG富集分析结果显示，INHBA及其互作蛋白主要功能富集于TGF-β信号通路与BMP/Smad信号通路，且其生物学过程（Biological process，BP）主要富集于通路中限制性调节因子SMAD蛋白磷酸化的正向调节，分子功能（Molecular function，MF）富集于SMAD蛋白的结合与激活，细胞成分（Cellular component，CC）富集于形成SMAD蛋白复合物。

3 讨论

INHBA蛋白是TGF-β超家族的一个配体，有9个半胱氨酸残基结构，定位于细胞胞质内，人INHBA基因位于7号染色体p15-p13上。INHBA亚基以二硫键聚合而成的二聚体抑制素A（Activin A）具有多种不同的生物学功能，在早期胚胎形成过程中能促进胚胎细胞的分化[10]，Activin A的长期暴露会促进癌细胞的生长、增强肿瘤的侵袭性以及抑制细胞凋亡[11- 12]。

多个研究报道，INHBA在多种不同的实体肿瘤中高表达，且其表达水平与疾病预后不良相关，包括多种消化道肿瘤，如胃癌、结肠癌、肺癌、食管腺癌等[2-3，13-15]，以及泌尿生殖系统肿瘤，包括膀胱上皮细胞癌、卵巢癌等[4，16]。在慢性粒细胞白血病（CML）中，有研究报道，INHBA在CML疾病的不同时期（慢性期、加速期、急变期）均异常高表达，尤其是急变期，且高表达INHBA的这部分CML患者对络氨酸激酶抑制剂的治疗反应更差[17-18];在弥漫大B细胞淋巴瘤中，INHBA起到抑制肿瘤细胞生长的作用[19]。

而为了探讨INHBA在AML中的临床意义，本研究团队在前期工作中检测了INHBA在成人初发AML患者MNCs中的表达，并分析其表达水平与患者临床特点、治疗反应及预后间的关系。结果首次发现INHBA的异常表达与AML患者的预后不良相关。在临床特点方面，高表达INHBA与AML患者高龄（>60岁）、染色体不良核型、合并貧血及FLT3-ITD基因阳性等相关;在治疗反应及远期疗效方面，高表达INHBA的这部分患者有着较差的临床预后，诱导治疗反应差、早期死亡率高、完全缓解率低、复发率高、总体生存率低。且进一步多因素分析发现，INHBA可能为AML预后不良的独立危险因素[7]。因此INHBA可能为与AML预后不良相关的分子标志物，但目前INHBA高表达影响AML患者预后的原因及其在AML发生发展中作用的内在机制尚未揭示。

本研究首先检测了INHBA在AML初治患者及正常成人骨髓MNCs中的表达水平，AML患者的INHBA表达要高于正常成人，但因对照组样本量较少，两组样本量差距较大，两组间未见明显差异。但此结果与前期已发表的实验结果一致，侧面证实INHBA在AML中可能促进肿瘤进展，也为后续进一步实验提供理论基础，可在此基础上扩大样本量进一步研究。其次，本研究在蛋白质水平上采用免疫组化及Western Blot两种方法验证了INHBA在AML不同细胞系中的表达，在蛋白质水平上证实了INHBA在AML中的表达。另外，通过STRING分析INHBA在蛋白网络调控中的作用，结果显示INHBA可能与FSTL3、ACVR2A、ACVR2B、ACVR1B、ACVR1C、ACVR1、ACVRL1、INHA、ENG、SMAD2、SMAD3、INHBB、SMAD4、IGSF1、FSHB、CGA、FKBP1A蛋白相互作用，进一步用KEGG富集分析INHBA及其互作蛋白的主要功能，显示主要富集于TGF-β信号通路与BMP/Smad信号通路，且其BP、MF、CC等富集于SMAD蛋白家族的互相结合、活化、磷酸化等功能的正负调节，为INHBA在AML中的表达调控研究提供了基本研究方向。

在利用数据库预测INHBA互作蛋白及相应生物学功能时，发现INHBA可能通过调控BMP/Samd通路来发挥作用，BMP/Smad通路是BMP信号通路活化的一个经典方式，在多种骨病及恶性肿瘤中表达失调[20]，且该信号通路在造血干细胞（Haemopoietic stem cells，HSCs）自我更新中发挥重要作用[18， 21]。细胞自我更新能力是HSCs无限增殖的重要原因之一。最新研究表明，白血病干细胞的自我更新机制依赖于BMP、TGF-β配体蛋白在骨髓微环境中的级联演化[17，22]。结合上述分析，提示INHBA在AML中可能参与调节白血病干细胞的增殖、分化等过程，从而促进肿瘤发生发展。

综上所述，本研究通过对AML中INHBA表达的分析，以及利用数据库及网页在线分析工具分析与INHBA相互作用的蛋白，INHBA可能通过调控TGF-β信号通路与BMP/Smad信号通路参与肿瘤的发生发展，为进一步研究INHBA在AML中的作用机制提供了研究方向和理论依据。

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（收稿日期：2020-07-31）