鲍曼不动杆菌产碳青霉烯酶对舒巴坦联合碳青霉烯抗生素协同作用的影响

王 博，磨国鑫，周 光，王韧韬，管希周，佘丹阳

1 解放军总医院研究生院，北京 100853；2 解放军总医院第八医学中心 呼吸与危重症医学部，北京100853；3 解放军总医院第一医学中心 检验科，北京 100853

鲍曼不动杆菌是医院感染的常见致病菌，碳青霉烯类抗生素曾是治疗鲍曼不动杆菌感染最重要的抗菌药物之一，但近年耐碳青霉烯鲍曼不动杆菌(carbapenem-resistant Acinetobacter baumannii，CRAB)检出率不断上升。据2018年CHINET中国细菌耐药监测结果，在我国临床分离的鲍曼不动杆菌中碳青霉烯耐药菌株的检出率已经高达78.1%[1]。在临床常用的抗菌药物中，只有多黏菌素和替加环素仍对其保持了较高的体外敏感度，但这两种体外敏感度较高的药物在单独用于治疗CRAB感染时，疗效并不能令人满意[2]。因此联合用药成为治疗CRAB感染的重要选择。近年来，针对酶抑制剂舒巴坦与碳青霉烯类药物联合方案的体外研究屡有报道。但这种联合方案对不同菌株的抗菌效应并不一致，对某些菌株具有明显协同抗菌效应的联合方案对另一些菌株却仅表现为无关效应[3-5]。这种联合抗菌效应的菌株间差异是否与细菌耐药机制有关，哪些碳青霉烯耐药菌株适合采用这种联合治疗方案，尚待阐明。本研究选取多中心教学医院的102株CRAB菌株，检测舒巴坦联合碳青霉烯抗生素对这些菌株的体外抗菌活性，同时从基因水平进一步分析CRAB菌株产β-内酰胺酶的情况对舒巴坦+碳青霉烯联合方案协同抗菌作用的影响。

资料与方法

1 菌株来源 2011 - 2014年全国13家教学医院(解放军总医院、北京医院、北京朝阳医院、北京大学第三医院、上海华东医院、广州呼吸病研究所、中国医科大学附一院、沈阳军区总医院、吉林大学第二医院、东部战区总医院、四川大学华西医院、山东省立医院、武汉同济医院)临床送检的102株CRAB菌株，所有菌株均分离自肺炎患者的下呼吸道分泌物标本。全部菌株均经VITEK-2微生物鉴定仪鉴定确认。

2 抗菌药物体外药敏试验 琼脂平板稀释法测定亚胺培南、美罗培南、氨苄西林/舒巴坦、哌拉西林他唑巴坦、头孢他啶、头孢哌酮/舒巴坦对102株CRAB菌株的最低抑菌浓度(minimum inhibitory concentration，MIC)。药敏试验的操作和敏感度折点判断标准(头孢哌酮舒巴坦除外)参照美国临床和实验室标准协会(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)2017年指南[6]。药敏试验的质控菌株为大肠埃希菌ATCC 25922、铜绿假单胞菌ATCC 27853。

3 体外协同抗菌试验计算部分抑菌浓度指数 按照棋盘法设计，采用微量肉汤稀释法分别测定舒巴坦和亚胺培南、舒巴坦和美罗培南两种联合方案对102株CRAB菌株的体外协同抗菌效应[7]。MH肉汤中最终的细菌浓度为105 CFU/mL，37℃培养18～24 h后观察结果。按照Doern[8]研究中记述的方法计算部分抑菌浓度指数(fractional inhibitory concentration index，FICI)并判读结果。FICI=联合甲药MIC/单用甲药MIC+联合乙药MIC/单用乙药MIC，FICI指数 ≤ 0.5、0.5～1(含1)、1～4(含4)和＞4分别表示协同、相加、无关和拮抗作用。

4 聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)扩增β-内酰胺酶编码基因和DNA测序 采用天根生化科技(北京)有限公司的细菌基因组DNA提取试剂盒提取受试菌株的全基因组DNA。本研究中使用的β-内酰胺酶编码基因PCR扩增引物、扩增片段长度及相应扩增条件见表1[9-11]。PCR扩增引物的合成和PCR产物的测序由TaKaRa Bio公司完成。PCR产物的测序结果在GenBank中进行序列比对分析。

表1 PCR引物序列Tab. 1 Primer sequences

结 果

1 6种β-内酰胺抗生素对102株鲍曼不动杆菌的体外抗菌活性 102株鲍曼不动杆菌至少对1种碳青霉烯抗生素敏感度降低。其中，100株鲍曼不动杆菌对亚胺培南和美罗培南均耐药，1株对亚胺培南耐药对美罗培南呈现中介状态(介于敏感、耐药之间)，1株对亚胺培南敏感、对美罗培南耐药。在4种非碳青霉烯β-内酰胺抗生素中，按照CLSI的敏感度折点判断标准，哌拉西林他唑巴坦和氨苄西林舒巴坦的敏感度均为0，仅头孢他啶对少数(15/102)CRAB菌株可以判断为敏感(3株CRAB的MIC值为4 µg/mL，12株的MIC值为8 µg/mL)。6种抗菌药物对102株鲍曼不动杆菌的体外抗菌活性见表2。

表2 美罗培南等6种抗菌药物对鲍曼不动杆菌的体外抗菌活性(n=102)Tab. 2 In vitro antibacterial activity of 6 antibacterial drugs against Acinetobacter baumannii (n=102)

2 舒巴坦联合美罗培南或亚胺培南对CRAB菌株的体外协同抗菌活性 在102株CRAB菌株中，美罗培南 + 舒巴坦、亚胺培南 + 舒巴坦两种联合方案协同效应的比例分别为21.57%和12.75%、相加效应的比例分别为71.57%和84.31%，无关效应的比例分别为6.86%和2.94%，在所有受试菌株中均未观察到拮抗效应。见表3。舒巴坦 + 碳青霉烯抗生素(亚胺培南或美罗培南)总共在30株(29.41%)CRAB中观察到了协同抗菌效应，其中有5株CRAB对舒巴坦 + 亚胺培南或美罗培南方案具有协同效应。

表3 舒巴坦分别联合两种碳青霉烯抗生素对102株CRAB的体外协同抗菌效应(n, %)Tab. 3 In vitro synergistic antibacterial effect of sulbactam combined with two different carbapenem antibiotics on 102 strains of CRAB (n, %)

3 CRAB菌株产β-内酰胺酶种类及其与体外协同抗菌试效应的关系 对102株CRAB的β-内酰胺酶编码基因进行扩增及测序的结果显示，全部CRAB菌株均产生OXA-23和OXA-51两种碳青霉烯酶。其中，19株CRAB还同时产生OXA-58型碳青霉烯酶，13株CRAB还同时产生GES-5型碳青霉烯酶，3株CRAB同时产生OXA-23、OXA-51、OXA-58和GES-5。除碳青霉烯酶外，部分菌株还同时产生CTX-M-2、CTX-M-9和PER-1等超广谱β-内酰胺酶，其中以CTX-M-2最为常见。在同时产生OXA-23、OXA-51和OXA-58的CRAB中，舒巴坦和碳青霉烯抗生素联用产生协同效应的比例最高，达到了56.25%(9/16)；在仅产生OXA-23和OXA-51的CRAB中，舒巴坦和碳青霉烯抗生素联用产生协同效应的比例为28.77%(21/73)；而在产生GES-5碳青霉烯酶的全部13株CRAB中(其中3株同时产生OXA-23、OXA-51、OXA-58和GES-5)，舒巴坦和碳青霉烯抗生素联用均未观察到协同效应。见表4。

表4 CRAB菌株产β-内酰胺酶种类及其与舒巴坦 + 碳青霉烯协同抗菌效应的关系Tab. 4 β-lactamases produced by CRAB strains and their relationship with the results of sulbactam + carbapenem synergistic antibacterial test

讨 论

鲍曼不动杆菌的耐药机制十分复杂，包括抗菌药物结合位点的改变、细菌外膜蛋白缺失、外排泵亢进、产多种抗菌药物灭活酶等[12]。其中，产生碳青霉烯酶是导致鲍曼不动杆菌对碳青霉烯抗生素耐药的主要原因。本研究对102株CRAB的β-内酰胺酶编码基因进行了比较全面的检测，结果显示全部受试菌株均携带blaOXA23和blaOXA-51，其中有19株同时携带blaOXA-58、13株同时携带blaGES-5。

研究显示OXA-23 + OXA-51、OXA-23 + OXA-58和OXA-23 + OXA-58 + OXA-51是CRAB最常见的三种复合产酶模式[13-18]。鲍曼不动杆菌逐步呈现多基因联合耐药模式。深圳人民医院的一项跨度为8年的研究中，临床分离231株CRAB进行耐药基因检测，22株(9.52%)呈现OXA-23 +OXA-58产酶模式，4株(1.73%)呈现OXA-23 +OXA-58 + OXA-51产酶模式[19]。Qu等[7]对华西医院2018年1-6月临床收集的89株CRAB进行耐药基因检测，OXA-23 + OXA-51复合产酶模式比例高达95.53%。与以往的研究相似，本研究中CRAB主要呈现OXA-23 + OXA-51复合产酶模式，少数菌株呈现OXA-23 + OXA-58 + OXA-51、OXA-23 + OXA-51 + GES-5 ± OXA-58复合产酶模式。这可能与鲍曼不动杆菌有较强的耐药基因获得能力有关，菌株间具有基因互换能力、缺乏mutS基因导致基因组修复能力缺陷、含有利于从周围环境中摄取DNA的基因等均会造成鲍曼不动杆菌复杂产酶情况[20-24]。GES-5作为由GES-1第170位甘氨酸转变为丝氨酸衍生而来的A类碳青霉烯酶，多见于铜绿假单胞菌[25-26]，其近年来也有少量出现在鲍曼不动杆菌的报道中[27]。既往报道的鲍曼不动杆菌复合产酶模式中未见OXA23 +OXA51 + GES-5(± OXA-58)的情况。

舒巴坦是一种β-内酰胺酶抑制剂，但本身对不动杆菌也有一定的抗菌活性。2007年Lee等[28]报道联合使用碳青霉烯和舒巴坦成功治疗了4例CRAB导致的菌血症。我们之前的研究结果也显示，舒巴坦联合碳青霉烯类药物治疗CRAB导致的医院获得性肺炎的3 d有效率和治疗终点(EOT)治愈好转率分别达到了82.35%和64.71%，归因死亡率仅为17.65%[29]。在体外研究中，多项研究结果也显示舒巴坦和碳青霉烯抗生素联用对部分CRAB菌株表现出协同抗菌效应[3-5]。本研究也获得了相似的结果。舒巴坦与碳青霉烯抗生素对CRAB产生协同抗菌效应的准确机制尚不完全清楚，推测可能与其抗菌作用靶位和酶抑制特性有关。就抗菌作用靶位而言，有研究结果显示舒巴坦主要通过抑制青霉素结合蛋白PBP1和PBP3对鲍曼不动杆菌产生抗菌效应，而美罗培南与鲍曼不动杆菌PBP1和PBP2的亲和性却明显强于PBP3[30]。因此，舒巴坦和碳青霉烯抗生素联合用于治疗鲍曼不动杆菌感染时，在抗菌作用靶位方面可能存在潜在互补效应。在酶抑制特性方面，尽管舒巴坦对大多数碳青霉烯酶的抑酶活性很弱或基本没有抑酶活性，对OXA-24、OXA-40、OXA-51等碳青霉烯酶的50%抑酶浓度(50% inhibition concentration，IC50)高 达40 ～190 µmol/L[31-33]，但对OXA-58的IC50却仅有2.5 µmol/L[34]。提示舒巴坦在较高浓度时有可能减少此类碳青霉烯酶对碳青霉烯抗生素的破坏作用。在本研究中，我们观察到，舒巴坦和碳青霉烯抗生素联用对三种不同碳青霉烯酶产生模式的CRAB菌株体外产生协同作用的比例有比较大差异，同时产生OXA-23、OXA-51和OXA-58的CRAB菌株产生协同效应的比例明显高于OXA-23 +OXA-51产酶模式和OXA-23 + OXA-51 + GES-5 ±OXA-58产酶模式的菌株，而且在产GES-5型碳青霉烯酶的CRAB菌株中，舒巴坦与碳青霉烯抗生素联合未发现体外协同效应。这一结果也间接支持舒巴坦对不同碳青霉烯酶的抑酶活性存在差异、对OXA-58有一定抑酶活性的推测。但单独用舒巴坦对不同碳青霉烯酶的酶抑制活性差异还不能完全解释本研究的结果，根据既往的研究结果，舒巴坦对GES-5的IC50为4.5 µmol/L[35]。提示舒巴坦对GES-5的抑制活性虽然略低于OXA-58，但却远高于对OXA-51等大多数碳青霉烯酶，这显然无法解释舒巴坦与碳青霉烯抗生素联合在所有产GES-5型的CRAB菌株中均未发现体外协同效应这一结果。比较合理的推测是这些CRAB菌株中可能存在产生GES-5伴随的其他非酶耐药机制，如作用靶位改变、主动外排表达亢进、外膜通透性降低等，这有待于在今后的研究中进一步证实。此外，GES-5和OXA-58对碳青霉烯抗生素和舒巴坦的水解失活能力是否存在差异，这种差异是否会影响碳青霉烯抗生素联合舒巴坦的协同效应，也值得深入探讨。

综上，本研究显示，舒巴坦 + 美罗培南或舒巴坦 + 亚胺培南两种联合方案在体外对部分产OXA型碳青霉烯酶的CRAB产生协同抗菌效应，其 中对产 酶 模式为OXA-23 + OXA-51 + OXA-58的CRAB产生协同效应的比例超过了50%，但对产GES-5型碳青霉烯酶的鲍曼不动杆菌未见协同作用。舒巴坦/碳青霉烯联用有望对部分产OXA型碳青霉烯酶的CRAB引发的感染带来治疗效益。