生骨再造丸对激素性股骨头坏死兔骨髓组织中微小RNA-708表达的影响

曹林忠 邬明峻 蒋玮 王多贤 张琪 刘孟初 马学强

激素性股骨头坏死(SANFH)是由于临床中糖皮质激素(GC)不规范使用或长期大量应用而引起的严重骨科疾病[1]。SANFH是治疗比较困难的一种骨关节疾病，没有及时发现和治疗导致股骨头塌陷后会引发髋关节骨关节炎，致使患者生活质量降低，社会及家庭经济负担加重。GC引起的BMSCs成骨-成脂分化失衡是SANFH发生的主要机制之一[2]，miRNA-708在GC相关疾病及多种骨科疾病中发挥了关键的调控作用。实验表明miRNA-708在SANFH患者股骨头组织中呈过表达，GC可导致BMSCs的miRNA-708表达水平增高[3]。但GC损伤机体骨组织分子机制不明确，临床尚未发现有效治疗药物。因此，如何有效阻断SANFH的进展，促进受损股骨头组织的恢复，是现代医学研究的重点。近年来，中医药防治SANFH取得了较好的临床疗效，生骨再造丸治疗早期SANFH疗效显著，但其确切的作用机制及更有效的治疗方法仍是当下研究的热点、难点[4]。本实验研究验证SANFH的发生与miRNA-708的相关性，明确生骨再造丸是通过抑制miRNA-708的表达以阻断SANFH的进展，从而为中医药防治SANFH提供分子生物学理论依据。

1 材料与方法

1.1实验动物

2.5个月龄健康普通级新西兰大白兔，50只，雄性，1.8～2.2 kg，西南医科大学实验动物中心提供，实验动物质量合格证号为SCXK(川)2018-17。

1.2实验药物及试剂

生骨再造丸(170803，甘肃中医药大学附属医院)；仙灵骨葆胶囊 (190106，国药集团同济堂制药有限公司)；注射用甲泼尼龙琥珀酸钠(X60842，Pfizer Manufacturing Belgium NV)；LPS(1001164401，SIGMA)；注射用青霉素钠(F8122301，华北制药股份有限公司)；L-DMEM培养基(CGM103.05，Cellmax)，H-DMEM培养基(CGM102.05，Cellmax)，碱性磷酸酶显色试剂盒(MA0197，大连美仑生物技术有限公司)，OriCell，间充质干细胞成骨诱导分化培养基试剂盒(RBXMX-90021，广州赛业生物)，油红O染色试剂盒(G1261，北京索莱宝)，Mir-X miRNA First-Strand Synthesis Kit(638313，Clontech)，流式抗体CD29(bs-0486R-PE)、CD34(bs-0646PE-cy7)、CD44(bs-2507R-APC)、CD45(bs-0522R-FITC)均购自北京博奥森；TB Green®Premix Ex TaqTMⅡ(RR920A，Takara)，miRNA-708-3p、miRNA-708-5p引物交由Takara公司设计。

1.3实验仪器

生物超净工作台(江苏苏净安泰公司)；摇床(北京六一仪器厂)；离心机(BECKMAN COULTER)；梯度PCR仪(Biometra)；实时荧光定量PCR扩增仪(Roch)。

1.4方法

1.4.1造模方法 实验组采用LPS联合甲泼尼龙琥珀酸钠法造模[5]，耳缘静脉注射LPS(10 μg/kg)、臀肌注射甲泼尼龙琥珀酸钠(20 mg/kg)，1次/d，共3次，臀肌处注射青霉素以预防感染。空白组给予耳缘静脉与臀肌注射等量生理盐水和青霉素。28 d后MRI验证造模成功。

1.4.2分组方法 将50只普通级新西兰大白兔按随机数字表法分为空白组10只，实验组40只，实验组造模成功32只，按照随机数字表法分为模型组10只，仙灵骨葆组11只，生骨再造丸组11只(兔的药物灌胃为有创操作，操作不当会引起死亡，导致药物干预失败，根据实际造模情况，药物组模型数量为11只)。

1.4.3干预方法 仙灵骨葆组以0.4 g/kg仙灵骨葆、生骨再造丸组以0.6 g/kg生骨再造丸灌胃28 d[6]，空白组和模型组给予生理盐水灌胃。

1.4.4标本制作方法 药物干预28 d后，仙灵骨葆组和生骨再造丸组各选取灌胃成功的10只，空气栓塞法处死，取出两侧股骨。Percoll法分离各组BMSCs，完全冲出骨髓，重悬、离心，弃上清，加入L-DMEM完全培养液重悬，铺于等量的Percoll分离液上，离心吸取白膜层，洗涤2次，弃上清；酶消法分离各组OB，将分离处理好的股骨头碾碎，加入适量胰蛋白酶，恒温摇床中预消化后离心，弃上清，加入3～5 mL 0.1%Ⅰ型胶原酶，恒温摇床中消化后离心，弃上清；密度梯度离心法分离各组脂肪细胞，将股骨从中间剪断，完全冲出骨髓，重悬、离心，吸取上层脂肪层；提取的BMSCs、OB、脂肪细胞加入5 mL H-DMEM完全培养基，移至37 ℃、5%CO2培养箱中培养，定时换液。

1.5实验指标测定

1.5.1BMSCs、OB和脂肪细胞的鉴定 各组P1代BMSCs、OB培养至约90%融合时流式细胞技术鉴定，培养至约90%融合时再诱导分化培养2～3周，BMSCs用碱性磷酸酶染色鉴定，OB用茜素红染色鉴定。初代脂肪细胞用油红O染色鉴定。

1.5.2qRT-PCR检测miRNA-708-3p和miRNA-708-5p 各组P1代90%融合的BMSCs、OB和初代脂肪细胞中加入MagZolTMReagent提取并测定各组细胞总RNA，miRNA按照试剂盒说明步骤反转录合成cDNA，qRT-PCR检测miRNA-708-3p和miRNA-708-5p表达水平。

1.6统计学方法

2 结果

2.1MRI验证结果

造模28 d，随机抽取8只行MRI验证，股骨头关节面及关节间隙正常，股骨头前上部T1WI为低信号、T2WI为高信号(见图1)。

图1 造模后影像资料

2.2BMSCs、OB、脂肪细胞鉴定结果

2.2.1BMSCs鉴定结果 流式细胞仪检测：CD29及CD44结果表达阳性，阳性率分别为为100%、99.5%；CD34及CD45结果表达阴性，阴性率分别为98.9%、97.0%(见图2)。对成骨诱导培养后BMSCs行碱性磷酸酶染色，镜下观察BMSCs呈现蓝紫色(见图3)。

图2 骨髓间充质干细胞CD29、CD44及CD34、CD45流式检测结果

图3 骨髓间充质干细胞碱性磷酸酶染色(×100)

2.2.2OB鉴定结果 流式细胞仪检测：钙粘蛋白表达阳性，阳性率98.37%；CD45表达阴性，阴性率99.97%(见图4)。茜素红染色：镜下可见红色钙化结节(见图5)。

图4 成骨细胞钙粘蛋白、CD34流式检测结果

图5 成骨细胞茜素红染色(×100)

2.2.3脂肪细胞鉴定结果 油红O染色：镜下见橘红色脂肪细胞(见图6)。

图6 脂肪细胞油红O染色(×100)

2.3qRT-PCR检测miRNA-708在各组BMSCs、OB、脂肪细胞中的表达情况

2.3.1miRNA-708-3p在各组细胞中的表达

1)BMSCs：模型组高于空白组，差异有统计学意义(P<0.01)；仙灵骨葆组、生骨再造丸组低于模型组，差异有统计学意义(P<0.01)；仙灵骨葆组对比生骨再造丸组，差异无统计学意义(P>0.05)，见图7。

图7 各组骨髓间充质干细胞中miRNA-708-3p的表达

2)OB：模型组高于空白组，差异有统计学意义(P<0.01)；仙灵骨葆组、生骨再造丸组低于模型组，差异有统计学意义(P<0.01)；仙灵骨葆组对比生骨再造丸组，差异无统计学意义(P>0.05)，见图8。

图8 各组成骨细胞中miRNA-708-3p的表达

3)脂肪细胞：模型组高于空白组，差异有统计学意义(P<0.01)；仙灵骨葆组、生骨再造丸组对比模型组，差异有统计学意义(P>0.05)，见图9。

图9 各组脂肪细胞中miRNA-708-3p的表达

2.3.2miRNA-708-5p在各组细胞中的表达

1)BMSCs：模型组高于空白组，差异有统计学意义(P<0.01)；仙灵骨葆组、生骨再造丸组低于模型组，差异有统计学意义(P<0.01)；生骨再造丸组对比仙灵骨葆组，差异无统计学意义(P>0.01)，见图10。

图10 各组骨髓间充质干细胞中miRNA-708-5p的表达

2)OB：模型组高于空白组，差异有统计学意义(P<0.01)；仙灵骨葆组、生骨再造丸组低于模型组，差异有统计学意义(P<0.01)；生骨再造丸组对比仙灵骨葆组，差异无统计学意义(P>0.05)，见图11。

图11 各组成骨细胞中miRNA-708-5p的表达

3)脂肪细胞：模型组高于空白组，差异有统计学意义(P<0.01)；仙灵骨葆组、生骨再造丸组对比模型组，差异有统计学意义(P>0.05)，见图12。

图12 各组脂肪细胞中miRNA-708-5p的表达

3 讨论

GC导致SANFH已成为临床共识，GC作为抗炎药被长期应用于临床是引起SANFH的重要原因。GC结合糖皮质激素受体(GR)可显著影响细胞代谢、存活、增殖和分化[7]。GR介导的信号可由miRNA-708启动子区域响应，从而引起细胞的一系列反应[8]。MicroRNA(miRNA)是一类小内源性非编码单链RNA，约含有19～23个核苷酸，可与目标mRNA的非翻译区结合，是转录后调控基因表达的关键调节因子，最新研究表明miRNA相关制剂有可能成为新的治疗药物[9]。miRNA在细胞分化、凋亡的过程中起着非常关键的作用。近年来，多项研究表明miRNA可调控骨代谢过程，是SANFH进展的重要因素。miRNA-708起最初被认为是一种可能的抑癌基因，miRNA-708的过表达可调节黏附分子和诱导骨髓分化，miRNA-708通过调控下游效应来影响关键基因，从而影响组织的自我更新及细胞的增殖、分化和死亡[10]。

Hao等[3]发现SANFH患者股骨头组织中miRNA-708高表达，体外细胞实验进一步证实GC可导致BMSCs中miRNA-708高表达。成骨分化特异性转录因子(RUNX2)和SMAD3可协同调节骨代谢。miRNA-708通过结合mRNA3’非翻译区(3′-UTR)调控SMADs激活转化生长因子-β(TGF-β)信号通路，TGF-β介导SMAD3在RUNX2基因处聚集，从而抑制或激活下游靶基因可调节蛋白形成。

miRNA-708-5p和miRNA-708-3p同源于前体miRNA-708，对骨质疏松症(OP)的发生具有协同作用。miRNA-708-5p和miRNA-708-3p在卵巢切除(OVX)大鼠和OP患者骨组织中均有高表达。miRNA-708-5p通过靶向介导SMAD特异性E3泛素蛋白连接酶-2对BMSCs的成骨细胞分化产生负调控作用，而miRNA-708-3p通过靶向结合小脑变性相关蛋白-1的翻译RNA对骨髓单核细胞中破骨细胞的分化调控[11]。Wu等[12]在胶原诱导的大鼠RA模型中注射miRNA-708-5p可以改善RA指数，降低Wnt3a/β-catenin在大鼠关节组织中的表达。研究发现miRNA-708-5p能诱导滑膜成纤维细胞MH7A凋亡，明显抑制细胞集落形成和迁移、Wnt3a/β-catenin信号通路的转录和蛋白水平。本实验通过LPS联合GC成功复制SANFH的模型，发现模型组BMSCs和OB细胞中miRNA-708-3p和miRNA-708-5p的表达量较空白组明显升高，表明miRNA-708-3p和miRNA-708-5p的上调参与了SANFH的发生。

生骨再造丸基于中医整体观念，以通阳、利湿、活血法立方，组方以淫羊藿、桂枝、黄芪、三七、泽泻等为主。方中君药淫羊藿、鹿角胶、骨碎补滋补肝肾，强筋骨；臣药黄芪、桂枝补益脾肺之气，配合利湿之泽泻，活血化瘀之丹参、三七、龙血竭、山楂等佐使药以通血脉，全方共奏通阳、利湿、活血之功。药理学研究表明，淫羊藿总黄酮可抑制核因子κB(Nuclear Factor kappa-B，NF-κB)信号通路的激活从而减少促炎因子表达和炎性浸润[13]。鹿角胶、骨碎补可补血活血、抗炎镇痛，预防骨质疏松[14-15]。黄芪多糖可降低细胞因子IL-1β、IL-6的分泌，促进BMSCs的增殖分化[16]，桂枝可发挥抗炎免疫作用，促进成骨细胞增殖[17]。其余利湿活血药物可改善股骨头微循环和促进骨愈合的疗效亦被证实。生骨再造丸治疗早、中期激素性股骨头坏死疗效确切[18]，低剂量生骨再造丸可显著改善模型大鼠的血脂水平、骨代谢水平、抑制炎症细胞因子，改善股骨头骨小梁密度水平及骨矿物含量，从而延缓SANFH的进展[6，19-20]。本实验研究发现生骨再造丸干预后SANFH中miRNA-708-3p和miRNA-708-5p的表达量明显降低，表明生骨再造丸通过降低miRNA-708的表达以治疗SANFH。

综上所述，miRNA-708在GC诱导的股骨头坏死中发挥着重要作用，生骨再造丸靶向下调BMSCs和OB中miRNA-708表达水平是治疗SANFH的主要机制之一。但生骨再造丸进入体内代谢后通过哪种信号通路下调miRNA-708的表达水平以及miRNA-708靶向抑制哪种下游关键蛋白或相关信号通路，从而起到抑制SANFH的作用，还需进一步的实验研究。