Menkes病二家系遗传学分析

彭 薇 王三梅 马 宁 杨 晓

中国人民解放军总医院第七医学中心 出生缺陷防控关键技术国家工程实验室儿童器官功能衰竭北京市重点实验室（北京 100700）

Menkes 病（MD，MIM 309400）是一种X 连锁隐性致死性疾病，新生儿的发病率为1/250000～1/100000[1]。MD 是由ATP 7 A（MIM 300011）基因变异引起的铜代谢异常疾病，该基因位于Xq12-q13.3，编码一种跨膜铜转运P型ATP酶。绝大多数的MD患者是男性，其母亲是杂合子携带者[2]。MD 根据表型和进展情况可以分为3 种类型。严重经典型MD（占90%～95%）在婴儿期起病，常见进行性神经系统变性、头发改变和结缔组织异常，多在3 岁内死亡；非典型轻度MD存活时间较长；枕骨角综合征（occipital horn syndrome，OHS）是以结缔组织异常为主要特征，是临床表现最轻的一种[3]。迄今为止共报道过3次中国人群的ATP7A基因检测结果，2008年报道1例MD患儿ATP7A基因的新发变异[4]，2014年报道3例MD患儿的临床与ATP7 A基因分析[5]，2017年对24例男性MD 患儿进行遗传学检测[6]。目前临床诊断MD 主要靠临床表现、影像学检查和实验室检查，明确诊断则需要进行ATP7A基因检测。本文报告2例MD患儿及其家系，分析其临床及遗传学特征。

1 临床资料

例1，男，2 月龄，孕36 周自然分娩，生后2 天因皮肤黄染入住重症监护病房，经治疗13 天后出院。出院后又发现吃奶差、皮肤苍白再次入住本院重症监护病房，治疗21 天出院。此次因3 天前间断抽搐5次第3 次入院。患儿抽搐时有眨眼、四肢向中位线抽动，偶伴吐沫。体格检查：头围37 cm（P3），肤色白皙，头发稀少、卷曲、脆黄，控头差，竖立不稳，追视稍差，追听可，肌张力减低。头颅大小正常，无畸形及肿块，眼距稍宽，眼裂小。胸廓对称无畸形，双肺呼吸运动对称，呼吸频率正常，叩诊清音，听诊呼吸音清晰，未闻及干湿啰音和胸膜摩擦音。心前区无隆起和凹陷，心尖搏动范围正常，心率118 次/min，心律齐，各瓣膜区未闻及心脏杂音。腹部平坦，腹式呼吸存在，无腹部静脉曲张，未见肠型及蠕动波，无压痛及反跳痛，未触及包块，肝肋缘下未触及，未触及胆囊，Murphy 征阴性。父母体健。实验室检查：血常规、血生化无异常，血浆铜蓝蛋白低3.8 mg/dL；血、尿遗传代谢筛查未见异常。脑电图示异常脑电图，睡眠期左侧顶、枕、中后颞区见稍多低-中波幅棘波、尖波散发或簇发。头颅核磁共振成像（MRI）示双侧顶枕叶、后联合异常信号，双侧额颞顶部蛛网膜下隙增宽（图1A）。

例2，男，4月龄，因精神运动发育落后1月余入院。患儿系G2P2，生后1月余可逗笑，可交流，后逐渐消失。入院表现为无意识交流，不可逗笑。患儿肤色白皙，头发稀少，追视、追听稍差，头控差，不会抓物，肌张力减低。体格检查：发育落后于正常同龄儿，面容正常，步态正常。头颅大小正常，无畸形及肿块，胸廓对称无畸形，双肺呼吸运动对称，呼吸运动和呼吸频率正常，双肺叩诊清音，听诊呼吸音清晰，未闻及干湿啰音和胸膜摩擦音。心前区无隆起和凹陷，心尖搏动范围正常，心率120次/min，心律齐，各瓣膜区未闻及心脏杂音。腹部平坦，腹式呼吸存在，无腹部静脉曲张，未见肠型及蠕动波，无压痛及反跳痛，未触及包块，肝肋缘下未触及，未触及胆囊，Murphy 征阴性，父母身体健康。实验室检查：血常规、血生化无异常，血浆铜蓝蛋白低6.3 mg/dL；血、尿遗传代谢病筛查未见异常。脑电图示异常脑电图，脑波活动轻度延迟，睡眠期双侧枕、后颞区见稍多量中高波幅棘波、棘慢波散发、簇发。MRI示脑外间隙增宽（图1B）。

图1 患儿颅脑MRI 表现

为进一步明确诊断及进行遗传咨询，经解放军总医院第七医学中心伦理委员会批准，征得研究对象监护人知情同意后，采集2 例先证者及其父母外周血各2 mL EDTA抗凝。应用北京Tiangen公司的TIANamp Blood血液基因组DNA提取试剂盒（目录号：DP318）提取全血基因组DNA。参照文献[7]共设计23 对引物，以覆盖ATP7A基因全部外显子及其侧翼序列，引物合成由上海生物工程有限公司完成。50 µL PCR反应体系包括：22 µL超纯水，25 µL PCR MIX（北京天根生化科技公司），引物（10 pmol/µL）各1 µL，1 µL DNA模板。PCR在GeneAmp PCR System 9700 PCR仪（Applied Biosystems）上完成。扩增产物用2%的琼脂糖凝胶电泳检测确定为特异性扩增产物后送至上海生工生物工程技术服务有限公司测序，使用Chromas软件将测序结果与人类基因库的ATP 7 A基因参考序列（NM_000052.6）进行比对，并用反向测序进行验证。

基因检测结果显示，例1 检测到ATP 7 A基因第21 外显子存在c.4077 dupT（p.Val 1360 Cysfs*7）（NM_000052.6）纯合变异，家系验证其父母均为野生型（图2 A）。该变异在gnomAD 数据库中频率为0，HGMD 数据库未见报道，美国医学遗传学与基因组学学会（American College of Medical Genetics and Genomics,ACMG）指南中将致病变异的证据分为非常强（very strong,PVS 1）、强（strong,PS 1-4）、中等（moderate,PM 1-6），或支持（supporting,PP1-5）。根据ACMG指南划分为致病变异（PVS1+PM2+PM6+PP4）。例2检测到ATP7A基因第10 外显子存在c.2354 delC（p.Pro 785 Leufs*9）（NM_000052.6）纯合变异，家系验证其父母均为野生型（图2B）。该变异在gnomAD数据库中频率为0，HGMD数据库未见报道，ACMG指南划分为致病变异（PVS1+PM2+PM6+PP4）。

图2 患儿家系ATP7A 基因测序图

2 讨论

MD 是一种X 染色体上ATP 7 A基因变异的致死性罕见遗传病。ATP 7 A在细胞质N-端含有6 个铜结合位点，8 个跨膜结构域（TM 1-8）和3 个细胞质结构域[2]。该病常见的临床表现包括毛发异常、癫痫发作、进行性智力发育落后、肌张力低下等，血浆铜蓝蛋白降低常可提示诊断，脑电图呈中至重度异常，在癫痫发作的不同阶段表现出不同特点[8]。MD 患儿早期头颅MRI表现可正常，随着病情发展可出现特征性影像学改变包括颅内血管迂曲、髓鞘发育不良、脑白质异常、脑萎缩、硬膜下积液或血肿等[9-10]。MD患儿新生儿期可出现持续性黄疸和喂养困难[5]，这与例1 患儿生后的临床表现类似。例1 患儿2 月龄出现癫痫发作，并伴有典型的毛发改变，肤色白皙，肌张力减低；血清铜和血浆铜蓝蛋白值降低；脑电图示稍多量中棘慢波散发、簇发；头颅MRI示双侧额颞顶部蛛网膜下隙增宽。例2 患儿临床表现为毛发异常，智力发育落后，肌张力改变；血清铜和血浆铜蓝蛋白降低；脑电图见稍多量中高波幅棘波、棘慢波散发、簇发；头颅MRI目前除脑外间隙增宽外未见明显异常。通过临床表现、实验室和影像学检查对2 例患儿可作出初步诊断。

对2 例患儿家系进行ATP 7 A基因检测发现，例1 患儿ATP 7 A基因第21 外显子存在c.4077 dupT/ p.Val 1360 Cysfs*7 纯合变异，该变异导致1360 位密码子编码的缬氨酸变为半胱氨酸，其后因产生移码而使终止密码子在1366 位氨基酸提前产生。该变异位于TM 7，父母均为野生型。该变异在gnomAD、HGMD数据库均未见报道，根据ACMG 指南划分为致病变异。1977年伊斯坦布尔大学遗传学系对41例经典MD患儿进行ATP 7 A基因检测，检测到1 例位于TM 7 的变异c.4030_4031 insTGCCA。2013 年哥本哈根大学又发现1例位于TM7的变异c.4057_4058dupAA，该患儿临床表现为典型的MD，19 个月死亡，家系中有其他成员受累发病[8]。本研究例2患儿ATP7A基因第10外显子存在c.2354delC/p.Pro785Leufs*9纯合变异，该变异导致785 位密码子编码的脯氨酸变为亮氨酸，其后因产生移码而使终止密码子在793位氨基酸提前产生。该变异位于TM4，理论上导致在跨膜结构域中段之后的蛋白功能丧失，父母均为野生型。该变异在gnomAD、HGMD数据库均未见报道，根据ACMG指南划分为致病变异。有研究发现第10 外显子上同一位点发生c.2354 dupC 变异，患儿临床表现为典型的MD，18个月死亡，患儿为家族中唯一发病成员[11]。

MD 可以分为3 种类型，有研究认为其临床表型与ATP7A基因变异类型密切相关[12]。ATP7A的致病性变异导致与铜转运障碍相关的多种临床可识别的表型，残留ATP 7 A功能的程度决定了其表型的严重程度[2]。研究发现，剪切变异可能产生一些有残留正常功能的蛋白质，更可能导致枕骨角综合征和轻型患儿；而严重的外显子缺失或无义变异常表现为严重的经典型MD，并在儿童早期死亡[13-14]；当蛋白功能剩余60%～70%时，可以表现为晚发的远端运动神经病[15]。结合基因型-表型关联分析这两例患儿更符合经典型MD。

截止目前，人类HGMD 数据库中共报道ATP 7 A基因的致病性变异约379 种，其中369 种变异与MD相关，错义变异约占32%，小的缺失、插入或重复变异约占22%，这些变异理论上导致截短蛋白的产生。目前的研究指出，最常见的变异类型为缺失和插入变异[16]。文献报道约2/3的MD患儿为遗传性变异，1/3为新发变异[17]，本研究的2例患儿均为新发变异。

目前MD早期可能有非特异性表型，血生化指标的特异度不高，并且缺乏有效的治疗手段，大多数未经治疗的患者在3 岁之前死亡，治疗成功率取决于开始治疗的时间和ATP 7 A基因变异的严重程度[18]，所以早期诊断和治疗尤为关键。基因分析是检测ATP7A变异的有效方法，国内积累的病例尚不能提供我国MD患儿ATP7A基因变异热点，不断丰富我国ATP7A基因的变异谱可为深入研究疾病的发病机制，探寻新的治疗方案提供理论基础。