辽宁省大菱鲆源弧菌的药物敏感性分析(上)

郭欣硕，徐小雅，黄萍萍，关 丽，罗 靳，郭 楠

(辽宁省现代农业生产基地建设工程中心，辽宁 沈阳 110032)

随着养殖规模的扩大、养殖密度的不断增加、饲养频率的提高以及养殖环境质量的不断下降，大菱鲆在养殖过程中也产生了许多疾病，例如细菌病、病毒病、寄生虫病等。其中，细菌病是我国大菱鲆养殖中受到损害最严重的一类疾病，据报道，我国大菱鲆养殖各种致病菌主要有大菱鲆弧菌、迟钝爱德华氏菌、鳗弧菌、鱼肠道弧菌、溶藻弧菌、大菱鲆源副溶血弧菌等，常引起鱼类的败血症、鱼皮下出血、鳞片黏膜脱落、鳍基部充血、溃烂症、腹水症、肠道白浊、肠黏膜腐烂脱落等，导致鱼的大量死亡，造成重大经济损失。因此，本研究选取大菱鲆源弧菌作为研究对象，并基于微量肉汤稀释法分析不同大菱鲆弧菌分离株的药物敏感性，以期为大菱鲆养殖过程中的疾病预警和安全用药及弧菌的防治提供理论参考和技术支持。

一、材料与方法

1.试验菌株

弧菌86株，分离自辽宁某地区大菱鲆，由辽宁省现代农业生产基地建设工程中心(疫病防控实验室)保存。菌株来源如表1所示。

表1 大菱鲆源弧菌的来源

2.细菌的培养

严格按无菌操作的技术要求，观察并选取典型细菌病症的新鲜个体，经过解剖后，将新鲜组织和典型病灶部位体液接种于两个选择性培养基平板上(弧菌分离培养选用TCBS培养基，爱德华氏菌的分离培养选用麦康凯培养基)，(28±1)℃连续培养18～24小时，观测菌落形态特征，挑选疑似的单个菌落，接种于普通营养琼脂平板上，(28±1)℃连续培养18～24小时，可得到纯菌株。

3.药敏试验

本试验所用药物为我国目前允许使用的水产用抗菌类药物：恩诺沙星、甲砜霉素、氟苯尼考、硫酸新霉素、氟甲喹、盐酸多西环素、磺胺间甲氧嘧啶钠、磺胺甲噁唑/甲氧苄啶。测试所用8种抗菌类药敏分析试剂板购自南京菲恩医疗科技公司，试剂板主要组成成分及板条设置见表2。

表2 试剂板主要组成成分及板条设置 微克/毫升

本试验方法参照试剂板公司提供的说明书，将传代培养基和获得的纯菌样品混合制成0.5麦氏浓度的菌悬液，取后混入无菌生理盐水，向阴性对照孔中依次加入200微升无菌生理盐水，再次吸取200微升菌悬液混入无菌生理盐水即可得到无菌样品稀释液。每孔分别加入200微升(阴性对照样品除外)，将已经加样好的药敏分析试剂板直接放入28℃的大型恒温培养箱中，经培养24～28小时即可读取试验结果。结果按照美国临床实验室标准研究所(CLSI)颁布的耐药性标准以及南京菲恩医疗科技公司提供的判定标准进行判定。

二、结果与分析

1.弧菌分离培养结果

2019年4－10月，分批次从两个定点养殖场的大菱鲆中选取具有典型弧菌病症的个体进行活体解剖，并选取了腹水、肝、脾、肾4个病灶部位，接种于TCBS选择性培养基和麦康凯琼脂培养基，用以分离弧菌和爱德华氏菌。6次共采集大菱鲆样品216份，分离培养菌株共390株，其中弧菌属202株，采集率约占总菌株数的52%，爱德华氏菌属31株，采集率约占总菌株数的8%。另有157株其他菌株，采集率约占总菌株数的40%。大菱鲆样品的数量、水温、时间、分离菌株数量详见表3。

表3 辽宁省菌株采集及分离情况

从表3可以看出，条件致病菌的弧菌均有检出，表明弧菌在该地区养殖的大菱鲆中广泛存在，并随着日期不同有所变化。在水温较高的环境下，病害高发的6－8月，弧菌的数量明显高于其他日期。爱德华氏菌分离到的数目相对较少，全年共分离到31株，其中在5月检出1株、7月检出24株、10月检出6株，其他日期未检出。结合当年葫芦岛大菱鲆养殖病害暴发情况及菌株鉴定结果可以得知，在水温相对偏高且病害高发的7月，爱德华氏菌检出的数量相对较多，爱德华氏菌可能是引起该地区当月大菱鲆发病的主要病原菌。

(待 续)