仙灵骨葆胶囊对大鼠肝损伤的作用及机制研究

丁海虎，倪 虹，王元元，陶 静，马善峰，陶明飞，孙思雨

(蚌埠医学院1.基础医学院机能实验中心；2.基础医学院生理学教研室；3.第二附属医院药剂科，安徽 蚌埠 233030)

肝纤维化(HePaticfibrosis,HF)是各种致病因素长期刺激肝组织后的损伤修复反应，是慢性肝病发展为肝硬化的必经阶段和共同病理途径[1]。肝损伤是肝纤维化的第一步，多种原因可导致HF的发生，如病毒性肝炎、酒精摄入、药物等。仙灵骨葆口服制剂是由淫羊藿、补骨脂、续断、丹参、知母、地黄六味中草药组成的复方制剂，具有滋补肝肾、接骨续筋、强身健骨的功效。2017年国家食品药品监督管理总局(CFDA)药品不良反应信息72期通报提示警惕仙灵骨葆口服制剂引起的肝损伤风险，不良反应表现包括肝酶水平升高、胆红素水平升高、肝细胞损害等[2]。该药在临床上用于骨质疏松、骨折等长期需要服用的代谢类疾病，其肝损伤作用的动物实验鲜有报道，本文拟初步探究仙灵骨葆在动物体内的肝损伤作用及可能的机制，为临床应用提供基础理论支持。

1 材料和方法

1.1 药品与试剂仙灵骨葆胶囊[国药集团同济堂(贵州)制药有限公司，批号：180807]；秋水仙碱片(云南植物药业有限公司，批号：20180603 )；基质金属蛋白酶9(MMP-9)，超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)检测试剂盒全部购自上海酶联生物科技有限公司(批号分别为：E30473、E34817、E30239、E34758、E35868)。

1.2 实验动物清洁级SD大鼠60只，购自安徽医科大学实验动物中心，生产许可证号SCXK(皖)2017-001号，雌雄不限，分笼饲养，体重(210±10)g。动物自由进食，任意饮水，12 h交替光照，恒温22 ℃，相对湿度50%～75%环境中适应性饲养7 d后实验。

1.3 仪器电子分析天平(上海精科)；酶标分析仪(Rayto RT-6100)；HH-8数显恒温水浴锅(国华电器有限公司)；冷冻高速离心机(德国EPPendorf)；电热鼓风干燥箱(上海新苗医疗器械)。

1.4 动物分组、给药与模型制备60只SD大鼠，按照体重采用随机数字表法随机分为5组，每组12只，分笼饲养。将动物分为：正常对照组、仙灵骨葆胶囊低、中、高组，[按“动物与人体每公斤体重折算系数表”，成人与大鼠折算系数为6.25，计算人与大鼠的每日灌胃剂量设定低、中、高三个浓度，分别为成人的等效剂量的1倍、4倍和10倍[3]，即0.27 g/(kg·d)、1.08 g/(kg·d)、2.7 g/(kg·d)、秋水仙碱组0.1 mg/(kg·d)，各组灌胃量均为10 mL/kg。正常对照组给予相同体积生理盐水，连续灌胃给药2周，末次给药后禁食(不禁水)16 h，20%氨基甲酸乙酯0.01～0.02 mL/g腹腔注射麻醉，腹主动脉采血收集血样。

1.5 大鼠体质量变化、一般情况及肝指数测定测定实验前后大鼠体质量变化、一般情况等并记录。待取血后分离并取出肝脏，预冷4 ℃生理盐水清洗血渍，滤纸吸去水分后进行称重，计算肝指数。肝脏指数=[肝脏湿重(g) /大鼠体重(g)]× 100%[4]。

1.6 生化指标检测肝功能取血后静置2 h，4 ℃冷冻高速离心机、3500 rpm离心10 min，取上层血清，酶标分析仪检测MMP-9、ALT，AST含量。称取0.4 g肝脏组织，加4 mL预冷生理盐水在冰上剪碎，后用组织匀浆器进行研磨，制备10%肝匀浆以检测MDA、SOD含量。MMP-9、ALT，AST、MDA，SOD含量的检测分别按照试剂盒说明书进行操作。

1.7 肝脏病理学检查取肝脏左外侧叶，放入4%的多聚甲醛溶液中固定，同一部位石蜡包埋、HE染色，光镜下观察肝脏组织病理变化并摄片。

1.8 统计学方法采用SPSS 25.0 统计学软件进行分析，计量资料数据结果以“均数±标准差”表示，若符合正态分布，采用单因素方差分析；组间两两比较，方差齐采用方差分析-LSD检验，方差不齐用Games-Howell检验；不满足正态分布时选择秩和检验。以P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠毛发、饮食等一般情况正常对照组大鼠毛色健康有光泽，性情温和，行为活动正常，精神状态良好，大小便正常；仙灵骨葆组低、高剂量组大鼠毛色无明显变化，中剂量组、秋水仙碱组大鼠出现竖毛粗糙，蜷缩不喜动，饮食饮水减少，大便稀软等现象。

2.2 各组大鼠体质量、肝指数变化实验前各组动物体质量无显著性差异，实验后仙灵骨葆各组体质量与正常组相比虽均有下降，但无显著差异，秋水仙碱组体质量显著下降(vs正常对照组P<0.01，vs仙灵骨葆组P<0.05)。用药后仙灵骨葆低、中、高剂量组和秋水仙碱组肝脏指数与正常组相比，均有显著下降(P<0.01)，见表1。

表1 仙灵骨葆胶囊对大鼠体质量与肝脏指数的影响

2.3 各组大鼠血清基质金属蛋白酶9( MMP-9)、谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)的变化仙灵骨葆各组、秋水仙碱组较正常组大鼠血清MMP-9均显著下降(分别为P<0.01、P<0.05)；而大鼠血清中的AST、ALT含量与正常组相比，仙灵骨葆低、中、高剂量组均显著升高(P<0.01)，秋水仙碱组亦升高明显(AST：P<0.05、ALT：P<0.01)。大鼠血清三个指标中，尤以仙灵骨葆中剂量组MMP-9含量降低及AST、ALT含量升高较为显著；秋水仙碱组与仙灵骨葆组均有显著差异(P<0.01或P<0.05)，但与正常组相比其表现出升高或者降低的水平较低，见表2。

表2 仙灵骨葆胶囊对大鼠血清基质金属蛋白酶9( MMP-9)、谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)的影响

2.4 各组大鼠肝组织超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)的变化与正常对照相比，仙灵骨葆低、中、高剂量组肝组织SOD含量均显著降低(P<0.01)。而肝组织MDA含量均显著升高(P<0.01)，而尤以中剂量组含量变化较明显。秋水仙碱组肝组织SOD含量与正常组相比无显著性差异，而肝组织MDA含量与正常对照组、仙灵骨葆组相比均有显著性差异(P<0.01)，见表3。

表3 仙灵骨葆胶囊对大鼠肝组织超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)的影响

2.5 各组大鼠肝脏组织病理学检查结果正常大鼠肝细胞排列整齐，结构完整，细胞质分布均匀，细胞核大而圆，核仁清晰，肝小叶结构完整规则，肝索呈放射状排列整齐。仙灵骨葆组大鼠肝细胞损伤与剂量成相关的表现出炎性细胞浸润，水肿明显，细胞边界模糊并出现坏死，可见肝小叶结构不规则，肝索排列紊乱。秋水仙碱组肝细胞变性坏死的损伤程度较轻，可见少量炎性细胞浸润，见图1。

图1 各组大鼠肝组织病理形态学的变化(HE染色，×100)

3 讨论

药物进入体内经消化、吸收、循环后将经过肝脏代谢，肝脏成为药源性损伤的主要靶器官之一。引起药物性肝损伤的前三位药物类别分别是中草药、抗结核药及抗微生物用药，损伤类型又以肝细胞型居多，在我国其构成比在整个药物不良反应中约占10%～20%[5]。仙灵骨葆胶囊是根据苗族民间验方研制而成，临床上常用于骨质疏松和骨质疏松症、骨折、骨关节炎、骨无菌性坏死等症。国家食品药品监督管理总局(CFDA)2017年发布药品不良反应信息通报，报道中收集了2004年1月1日至2016年7月21日的仙灵骨葆口服制剂不良反应报告2665例，其中严重报告81例(3.1%)，在81例严重不良反应报告中肝胆系统损害占比较高，表现出肝酶水平升高、胆红素水平升高、肝细胞损害等症状。李珊[6]等报道了39例仙灵骨葆胶囊不良反应/事件分析，结果显示累及器官相对单一，主要表现为肝损伤(17例，43.59%)。秦子飞[7]等确认了“仙灵骨葆”13 个吸收入血原型成分，结果提示淫羊藿、补骨脂、续断和知母四味中药内的成分可能对该药体内发挥作用较大。仙灵骨葆胶囊所致肝损害，其制剂中的淫羊霍和补骨脂均被怀疑为具有肝毒性[8]，淫羊藿具有雄激素样作用，可干扰肝细胞正常代谢引起肝内毛细胆管的胆汁淤积而出现肝功能异常[9]。目前，临床上治疗心脑血管疾病和骨质疏松等疾病都需长期服药，这势必要求对药物的安全性评价应更加予以重视。

肝脏血清酶活性的升高或蛋白质下降水平与肝实质受损程度呈一定相关性[10]，结果显示血中ALT、AST升高提示仙灵骨葆胶囊对肝细胞造成损伤后使细胞膜通透性增加，另SOD活性显著下降、MDA含量显著升高，其机制可能是和肝细胞受损后有氧氧化能力降低有关；SOD通过负反馈调节作用消耗增大,也可导致SOD活性减低，而MDA水平升高提示肝细胞脂质过氧化。HE染色结果显示随着仙灵骨葆剂量增大呈现出正程度相关的肝细胞损伤和单核细胞浸润等肝脏炎症早期病变，提示仙灵骨葆引起肝细胞损伤可能是对机体免疫功能的影响造成。本文观察到体质量、组织形态学结果仙灵骨葆高剂量组较中剂量组肝损伤作用较明显而生化指标中剂量组变现出更大的毒性，推测其可能原因为中剂量组灌胃水溶液溶解度高表现出较优的药代动力学，而高剂量组因其浓度高对肝细胞具有较高的线粒体损伤作用。

肝内的细胞外基质(ECM)过度沉积是肝纤维化的主要特征，在生理及病理状态下降解主要由基质金属蛋白酶(MMPs)完成。MMP-9属于明胶酶B类，属肝内该家族之一，在正常肝脏，基质金属蛋白酶-9的表达较强[11]，本实验结果提示仙灵骨葆引起肝损伤后MMP-9活性降低而使得ECM的降解能力下降，可能对肝损伤后的肝纤维化进程有一定的促进作用。秋水仙碱在临床上常用于治疗痛风和抗肿瘤，相关报道提示秋水仙碱具有抗炎和破坏微管蛋白的作用或极有可能也是抑制枯否细胞的分化起到抗肝纤维化作用[12-13]。而本文结果显示与相关研究[14]与有所关联，表现出对大鼠肝组织具有一定的损伤作用，其对在体动物肝的作用还需进一步验证。

综上所述，本文初步对仙灵骨葆胶囊制剂造成大鼠肝损伤进行了研究，为临床用药提供基础的理论支持，其肝损伤的机制有待在细胞、分子等水平做进一步深究。