盐胁迫对2种冷季型草坪草幼苗生长和生理特性的影响

陈雅琦,苏楷淇,李春杰

(兰州大学草地农业生态系统国家重点实验室，兰州大学农业部草牧业创新重点实验室，兰州大学草地农业教育部工程研究中心，兰州大学甘肃省西部草业技术创新中心，兰州大学草地农业科技学院，甘肃 兰州 730000)

土壤盐碱化严重危害人类的农业，工业，畜牧业等生产活动，并且对人类生存环境产生重要影响。在中国，盐渍土壤面积约为3 460万hm2，盐渍化耕地面积近760万hm2[1]。土壤盐渍化造成大面积土地难以利用，严重危害西北旱区农业和绿色产业的发展。盐渍土壤中以中性盐NaCl为主，中高浓度的Na+和Cl-对植物的生长有着严重的阻碍作用[2]。高盐生境下的植物因极高浓度的单盐离子，会出现生理干旱，同时，Na+和Cl-还会影响植物对土壤中其他有益营养元素离子如K+、Ca2+的吸收，产生拮抗作用[1]。此外，盐胁迫还会致使植物体内累积大量的活性氧类物质(ROS)，严重时会发生膜脂过氧化现象，植物细胞脂质层被破坏，蛋白质发生分解，甚至引发DNA的解旋，使植物受到不可逆转的伤害[3]。植物对盐逆境的响应机制包括渗透调节作用、抗氧化酶清除系统等，如提高体内抗氧化酶(如POD、SOD)的活性，清除因逆境产生的ROS以降低植物细胞伤害；提高细胞内渗透物质如脯氨酸的含量，保持植物与外界的渗透平衡以减少不必要的水分流失[4-6]。大量研究表明，幼苗阶段的良好生长对植物后期抗盐碱能力的提高有重要作用，研究盐逆境下植物幼苗阶段的生长状况与生理特性，对于阐明植物耐盐机制、选育及栽培适宜西北地区的耐盐草种、提高土地利用率具有重要意义。

醉马草(Achnatheruminebrians)为我国西北天然草原常见草种，为禾本科芨芨草属[7]。醉马草生长快、竞争力强，并携带一种内生真菌，此内生真菌于1994年被发现并于2005年被命名为Epichlogansuensis[8-9]。研究表明，Epichlogansuensis的存在提高了醉马草对干旱、盐碱、高温等逆境的抗性[10]。近年来对醉马草的研究多集中于醉马草内生真菌共生体对非生物胁迫的响应和保护机制、优良草坪草种的选育方面。

高羊茅(Festucaarundinacea)为我国常用冷季型草坪草种，禾本科羊茅属，因其具有生长快、抗病害、土壤适应性广、耐粗放管理等优良草坪草特性[11]，为我国目前应用最为广泛和增长量最快的草坪草种[12]，常作为先锋草种广泛应用于住宅、公园等地。

近年来，由于土地盐渍化面积日益增加，土地资源愈发紧张，土地盐碱化已成为制约我国西北地区绿色产业发展和生态环境恢复的重要因素，故耐盐草坪草的选育与研究已成为亟待解决的关键问题。本试验比较醉马草和高羊茅的抗盐性，为醉马草作为抗盐碱化优质草坪草的应用提供科学依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

供试材料为西北地区常见禾草，共2属4种种质。分别为带菌醉马草(A1)，不带菌醉马草(A2)，高羊茅品种侠客岛(A3)和猎狗6号(A4)，高羊茅种子由甘肃红瑞园林绿化工程有限公司提供。供试醉马草种于2019年8月采自甘肃省夏河县(E 102°33′，N 35°11′)，镜检检验其带菌率为100%，将其中一半醉马草种浸泡于稀释100倍的70%甲基托布津2 h以灭菌，灭菌后再次镜检，直至确认带菌率为0%，得到不带菌的E-醉马草种(A2)。其后将A1、A2、A3、A4 4种种质在5℃下密封保存，试验前采用物理方法打破种子休眠[12]以供后续试验使用。

1.2 试验方法

试验在甘肃省兰州市榆中种质资源温室试验点(E 104°39′E,N 35°89′)进行。取塑料花盆，高温210℃灭菌后的蛭石和土壤混合为花盆基质，每盆播种5粒种子，置于温度(26±2)℃、湿度(42±2)%的环境下萌发。待幼苗长至2 cm进行盐溶液胁迫试验。分别将质量分数为0.1%(C1)、0.3%(C2)、0.5%(C3)、0.7%(C4)、0.9%(C5)的NaCl溶液作为盐胁迫处理液，对4种种质幼苗进行胁迫处理，蒸馏水处理作为对照组CK。第1次胁迫处理时各处理组均加入15 mL处理液，此后每2 d定量浇灌1次以保持相应盐胁迫环境，并随机摆放花盆，试验处理持续12周。

1.3 测定指标

试验结束后，每盆随机选取3株植物，将根部基质清洗干净，用吸水纸将根部水渍吸干后将植株放置于4℃冰箱，以供后期测定试验指标。

1.3.1 苗长和根长 将处理好的植株地上部分和地下部分用剪刀小心分开，将地上/地下部分拉直，使用直尺测量苗长与根长。

1.3.2 根冠比 分别称量地上/地下部分的质量，依据公式根冠比=地下鲜重/地上鲜重计算根冠比。

1.3.3 Na+和K+含量测定 参照缑小媛[13]方法，将4种种质幼苗连根一起整株挑起，洗净后，用蒸馏水再度漂洗，吸干水分后将茎叶和根系分开，分别称鲜重。105℃下杀青10 min，60℃烘干后称重，其后采用火焰光度计法测定Na+和K+，计算Na+/K+。

1.3.4 生理特性指标测定 参照张殿忠等[14]的磺基水杨酸法测定脯氨酸(proline)含量；参照林植芳等[15]的硫代巴比妥酸(TAB)法测定丙二醛(MDA)含量；参照袁朝兴和丁静[16]的愈创木酚法测定过氧化物酶(POD)活性，参照李合生[17]的氮蓝四唑法测定超氧化物岐化酶(SOD)活性。

1.3.5 模糊隶属函数综合评价 采用模糊隶属函数法分别计算E+和E-醉马草种子萌发阶段及幼苗生长阶段的耐盐隶属函数值，并据此对E+和E-醉马草耐盐性进行综合评价。其计算公式如下：

(1)

(2)

式中：μ(Xj)代表第j个指标的隶属函数值；Xj代表第j个指标值；Xmin代表第j个指标最小值；Xmax代表第j个指标最小值；耐盐性与指标呈正相关时采用公式(1)计算，呈负相关时则采用公式(2)进行计算。

1.3.6 单项指标主成分分析 为明确可作为对比筛选醉马草耐盐性的主要指标，对E+和E-醉马草的XX个单项指标的耐盐系数ω分别进行主成分分析，其计算公式如下：

ω=不同混合盐胁迫处理液浓度下的单项指标平均测定值/对照组测定值

1.3.7 耐盐性评价指标 分别以A1、A2、A3、A4种质种子的相对胚根长为因变量(y)，以NaCl浓度为自变量(x)建立函数方程，以相对胚根长下降50%时所对应的NaCl浓度作为4种种质幼苗的耐盐阈值。

1.4 数据处理

采用Excel 2010统计数据并制图，采用SPSS 20.0软件进行数据分析。

2 结果与分析

2.1 盐胁迫对4种种质幼苗生长的影响

4种种质幼苗的苗长均随盐浓度的上升呈下降趋势(表1)。当盐浓度较低(0.1%和0.3%)时，4种种质苗长较CK无显著差异，且盐胁迫具有轻微促进幼苗生长作用，而高浓度盐溶液(0.7%和0.9%)下A4幼苗长度较CK分别下降20.80%和21.72%，呈显著差异(P<0.05)。

4种种质幼苗的根长均随着盐浓度的上升呈现下降趋势，其中低中度盐胁迫下各种质幼苗根长与对照组无显著差距，表明轻微盐胁迫对幼苗根长无显著抑制效果；当盐浓度为0.1%和0.3%时，4种种质幼苗根长趋势与苗长趋势相同，表现为较CK组对照无显著差异；当盐浓度为0.9%时，A1、A2、A3和A4根长较对照组分别下降了61.54%，35.90%，39.02%和44.73%，表现出显著差异(P<0.05)(表1)。

随着盐浓度的升高，4种种质幼苗根冠比呈现出下降的趋势。与对照组相比，当盐浓度较低时(0.1%和0.3%)，高羊茅和醉马草根冠比呈现上升趋势；而重度盐胁迫(0.7%和0.9%)则会显著抑制醉马草根冠比，且呈现显著差异(P<0.05),分别下降37.14%和54.29%；37.14%和37.14%。高浓度盐胁迫下，4种种质幼苗生长下降趋势为A3>A4>A2>A1(表1)。

表1 盐胁迫下幼苗的苗长、根长和根冠比

2.2 盐胁迫对4种种质幼苗Na+/K+的影响

4种种质幼苗的Na+/K+均随盐浓度的升高呈显著上升的趋势，且皆在盐浓度为0.1%及以上时与对照组显著差异(P<0.05)(图1)。A1、A2、A3、A4均在盐浓度为0.9%时Na+/K+到达顶峰，分别为对照组的1.70、2.00、2.82和2.75倍。在不同NaCl环境下，4种种质幼苗的Na+/K+大小排序均依次为A3>A4>A2>A1(图1)。

图1 盐胁迫下幼苗Na+/K+

2.3 盐胁迫对4种种质幼苗proline含量的影响

任一盐浓度下，4种种质幼苗的proline含量均显著高于其对照组(图2)，且4种种质幼苗的proline含量均随盐浓度的上升呈先升高再下降的趋势，在0.5%中度盐胁迫时最大，较对照组分别提高了76.50%、64.61%、33.78%和64.88%。此外，4种种质幼苗的proline含量大小排序依次为A1>A2>A4>A3，且A1与A2的proline含量显著高于A3与A4。说明醉马草可提高proline的含量，减缓NaCl引起的渗透胁迫，且内生真菌的存在显著提高了A1抗盐胁迫的能力。

图2 盐胁迫下幼苗proline含量

2.4 盐胁迫对4种种质幼苗MDA含量的影响

4种种质幼苗的MDA含量均随盐浓度的升高呈显著上升趋势，且皆在盐浓度为0.1%及以上时与对照组差异显著(P<0.05)(图3)。其中A1、A2、A3、A4均在当盐浓度为0.9%时MDA含量最大，分别为对照组的0.84、0.95、1.63和0.43倍。A3的MDA含量在盐浓度为0.3%和0.5%的中度盐胁迫下无显著差异，A4的MDA含量在盐浓度为0.1%、0.3%和0.5%、0.7%的低、中度度盐胁迫下无显著差异。表明盐胁迫可显著提高醉马草幼苗的MDA含量，重度盐胁迫可显著提高羊茅幼苗的MDA含量。4种草坪种质MDA含量大小排序依次为A3>A4>A2和A1，说明高浓度NaCl胁迫加深细胞质膜的受损程度。

图3 盐胁迫下幼苗MDA含量

2.5 盐胁迫对4种种质幼苗POD活性的影响

供试任一盐浓度下，4种种质禾草幼苗的POD活性均显著高于其对照组(图4)，且4种种质禾草幼苗的POD活性均随盐浓度的上升呈现先升高再下降的趋势，在0.5%中度盐胁迫时到达顶峰，较对照组分别提高了28.09%，28.57%，14.59%和19.64%；在0.7%和0.9%的重度盐胁迫下出现显著降低，较顶峰值分别降低了5%和7.21%；5%和6.38%；6.36%和9.56%；4.22%和4.55%。此外，4种禾草幼苗的POD活性大小排序依次为A1>A2>A4>A3，且A1与A2的POD活性显著高于A3与A4(P<0.05)。

图4 盐胁迫下幼苗POD活性

2.6 盐胁迫对4种种质幼苗SOD活性的影响

任一盐浓度下，4种种质幼苗的SOD活性均显著高于其对照组(图5)，且4种幼苗的SOD活性均随盐浓度的上升呈现先升高再下降的趋势。A1和A2在0.7%重度盐胁迫时达到顶峰，较对照组分别提高了1.18倍和0.82倍；而A3和A4在0.5%中度盐胁迫时到达顶峰，较对照组分别提高了0.51倍和0.40倍。

图5 盐胁迫下幼苗SOD活性

4种禾草幼苗的POD活性大小排序依次为A1>A2>A4>A3，且A1与A2的SOD活性显著高于A3与A4。重度盐胁迫下A1和A2的抗氧化酶活性最高，而A3和A4的抗氧化作用显著降低。由此说明内生真菌的存在可显著提高醉马草的抗氧化酶的活性。

2.7 4种种质幼苗综合耐盐性评价

4种种质幼苗隶属函数值排序及耐盐性从大到小依次为：A1> A2> A4> A3(表2)。

表2 盐胁迫下4种种质幼苗隶属函数值

4种种质幼苗耐盐性指标主成分分析的第Ⅰ主成分特征值λ1=4.469，贡献率为55.864%，耐盐性指标所对应的特征向量中，POD测定和SOD测定数值较大，分别为0.403和0.421，主要反映出NaCl胁迫下4种禾草幼苗的抗氧化酶活性；第Ⅱ主成分特征值λ2=2.751，贡献率为34.391%，对应的特征向量中，根长和MDA含量数值较大，分别为0.572和0.482，主要反映出NaCl胁迫下胚根生长和膜结构的完整性(表3)。综上可知，Ⅰ和Ⅱ主成分分别反映了4种禾草幼苗8个耐盐性指标90.255%的信息，对4种禾草幼苗耐盐性综合评价的指示意义较大。因此，POD活性、SOD活性、根长、proline含量可作为4种禾草幼苗耐盐性综合评价的主要指标。

表3 4种种质幼苗耐盐性指标的主成分分析

将4种禾草幼苗的相对胚根长度与盐浓度进行曲线回归分析，结果表示A1、A2、A3、A4的相对胚根长与盐浓度之间均呈现良好的三次曲线函数关系(表4)。由建立的最优函数方程可知，在幼苗生长阶段，A1、A2、A3、A4的耐盐阈值分别为0.061%、0.050%、0.002%、0.021%。从大到小依次为A1>A2>A4>A3。综上可知，在幼苗生长阶段，A1耐盐性最优、A3为最差。

表4 盐胁迫下4种种质幼苗生长阶段耐盐性回归分析

3 讨论

3.1 盐胁迫对幼苗生长的影响

植物的生长会受到多种环境因素的影响，如干旱，水涝，盐碱胁迫等。其中，盐碱胁迫对植物的生长影响最明显[18]。试验结果显示，醉马草和高羊茅草种在不同浓度的盐溶液中，其苗长和根长均呈现随着盐浓度上升而下降的趋势，根冠比也呈现出相同的变化趋势且差异显著(P<0.05)，并且由于根重和苗重同时下降，说明盐胁迫对高羊茅和醉马草的地下部分影响较大。相比于高羊茅，醉马草的根冠比在重度盐胁迫下较对照组下降略大，这可能是醉马草地下部分生物量的下降引起较为显著的根冠比的下降。但是王宝山[18]证明当植物处于盐渍土壤时，植物地上部分的生长受抑制程度明显大于根。这主要是因为成熟叶片最先受到单盐胁迫，受胁迫时间最长，表现在鲜重的下降，生长受到抑制，导致叶片中叶绿素含量降低，光合作用被严重影响，继而地上部分的生长严重低于地下部分。因此，本试验结果其可能的原因是醉马草中存在的内生真菌有效地减少了对地上部分的损害，相对于地下部分生物量的下降，间接地显著降低了根冠比。

3.2 盐胁迫对幼苗生理特性的影响

当植物处于逆境环境时，植物细胞质膜透性增加，体内无机盐和离子等会渗透到外界。植物中Na+的积累会影响植物对其他离子如K+，Ca2+等的吸收而产生拮抗作用[19]。离子毒害会破坏植物的营养结构，影响植物正常的生理代谢活动，Na+/K+被视为衡量植物体内离子平衡的指标[20]。K+可以调控植物体的离子平衡，提高促进渗透调节的效率[21]。本研究中当高羊茅和醉马草处于盐胁迫环境下，Na+的吸收呈现上升趋势，说明带菌醉马草具有较强的耐盐碱性，且吸收和平衡Na+的能力较高，这与岳利军[22]对沙芥(Pugioniumcornutum)的研究结果一致。

渗透调节是植物对抗逆境胁迫最重要且最为有效的机制[23]。渗透调节通过植物调节自身的渗透压，改变水势，从而使得细胞维持一定的压力，减少植物失水。在盐分的压力下，由于细胞外水势低于胞内水势，细胞内水分向外倒流，造成植物缺水，影响体内正常生理活动。因此，渗透调节主要是通过有机物和无机离子的互作，降低植物水势，维持植物体内水分运输，减少对生理代谢活动的伤害。并且，当植物处于盐渍环境，某些过量离子，如Na+或Cl-会抑制植物某些酶的活性，因此，植物在盐碱环境中细胞会合成大量有机渗透调节物质，如脯氨酸，可溶性糖等来降低水势，进行渗透调节[23]。游离脯氨酸是植物体内常见的调节渗透压力的物质，并且游离脯氨酸的变化可以看作植物对抗逆境胁迫的信号[24]。其合成和积累一方面可以降低细胞渗透势，提高植物自身对水分的维持，另一方面脯氨酸对植物体内其他酶类物质具有保护作用。并且，因为脯氨酸是中性氨基酸，其大量积累不会引起植物体内酸碱平衡的变化[23]。本研究当植物处于盐胁迫下，其脯氨酸含量较对照组均呈现上升的趋势。0.5%盐胁迫下的脯氨酸含量到达顶峰，继而下降，可能的原因是重度盐胁迫破坏植物体内合成和积累脯氨酸，或者抑制酶的合成等生理活动。鲁艳等[25]对大果白刺幼苗(Nitrariaroborowskii)的研究表明脯氨酸含量具有显著的清除ROS物质的作用，与本文结果一致。

MDA是膜脂过氧化的中间产物和最终产物，其对植物的伤害表现在MDA与细胞中的蛋白质相结合，破坏蛋白质原有的结构和功能[26-28]。MDA对植物的影响包括抑制细胞中蛋白质的合成，降低蛋白质活性等[28]。醉马草和高羊茅体内MDA呈现上升趋势，说明不同盐胁迫对植物造成了伤害，这与寇江涛[29]研究结果一致。

当植物处于盐渍土壤时，植物体内活性氧受到影响，积累产生大量活性氧类物质(ROS)，引发膜脂过氧化，对细胞膜造成破坏[23，26]。植物清除体内活性氧类物质依靠活性清除系统，包括POD和SOD等。其主要机理是植物在逆境中产生和积累SOD以清除多余的自由基等活性氧类物质，SOD与过氧化氢酶(CAT)协同将H2O2转化为H2O，POD与CAT联合作用清除体内过量的H2O2，从而使二氧化碳固定的效率保持稳定[26]。其中，POD清除ROS过程与CAT过程不同，POD是通过催化底物，与过氧化氢产生反应来降低H2O2的含量，而CAT则是直接催化H2O2从而降低其含量。大量文章[30-32]表明逆境环境破坏植物体内过氧化代谢平衡，从而增加体内自由基物质，造成膜脂过氧化，使得细胞膜结构和功能遭到破坏[33]。本研究抗氧化酶在植物体内呈现先上升后下降的结果(图4～6)，可能的原因是植物体内合成和积累抗氧化酶的蛋白质等物质在高盐浓度下受到抑制，但是相较于对照组，均呈现出显著上升趋势(P<0.05)，且A1抗氧化酶活性较A2、A3和A4高。

3.3 综合耐盐性评价

模糊隶属函数法可综合各耐盐性指标，依据其隶属函数值排序综合评价4种禾草幼苗的耐盐性，可避免单一指标评价所带来的片面性，从而更加客观真实[33]。盐胁迫下的A1幼苗苗长、根长及抗氧化酶活性、脯氨酸含量等指标最优，A3最差。本研究通过建立模糊隶属函数，最优函数方程明确了4种种质幼苗生长阶段的NaCl耐受性依次为A1>A2>A4>A3，和单一指标评价结果一致。综上所述，带菌醉马草对NaCl单盐胁迫具有耐受性，作为西北盐碱地区的新型草坪草种具有发展潜力，可提高西北地区土壤资源利用率并缓解盐渍化带来的危害。

4 结论

以醉马草和高羊茅幼苗作为研究对象，分析了不同浓度的单盐胁迫(0.1%，0.3%，0.5%，0.7%和0.9%)NaCl对幼苗生长和幼苗生理的影响，并对其耐盐性进行综合评估。结果表明：1)随盐浓度的升高，4种质草种的幼苗生长均受到抑制。2)轻度盐胁迫(0.1%和0.3%)对于带菌及不带菌醉马草的幼苗生长具有一定的促进作用。3)4种草种的综合耐盐性依次为：带菌醉马草>不带菌醉马草>高羊茅“猎狗6号”>高羊茅“侠客岛”。带菌醉马草耐盐性最佳并具有抗盐碱化的优良草坪草种特性，具有成为西北地区优良草坪草种的巨大潜力。