一种中药配伍活性成分的提取及其体外抑菌性*

张 剑，张 博，张 寒，徐 豪，刘春叶

(西安医学院 药学院，陕西 西安 710021)

中药配伍是在中医学基础理论和临床经验指导下，将多种中药配伍在一起，用以更好治疗疾病，是中医药的核心[1-3]。近年来，现代方剂配伍相容性研究日益受到人们的重视，并逐渐成为中医药现代化研究的重要组成部分[4-6]。中药配伍法则是中药复方理论的精华，复方配伍产生的中药多成分、多靶点、多途径的治疗作用为中药新药研发提供了理论指导和实践依据。单味中药经配伍后可以达到减毒、增效的效果[7]。

黄连中含有盐酸小檗碱,在体外对多种革兰阳性及阴性菌均具抑菌作用,目前认为是黄连的主要抑菌成分之一[8-9]；苦参中主要含有生物碱类和黄酮类成分，具有抑菌、抗菌、抗炎、抗氧化等功效[10-11]。甘草根及根茎的主要成分是甘草酸，甘草酸具有抑菌、抗氧化、抑制人类免疫缺陷病毒、增强免疫、保护等方面的药理作用[12-13]。将黄连-苦参-甘草等药以不同比例配伍，产生不同的临床效果。

作者选择黄连、苦参、甘草组成中药抑菌配方，通过对配方中有效成分进行提取，并运用药敏实验和提取液的吸光度来确定最佳抑菌效果的配方比例，以期为中药复方抑菌处方的研制提供借鉴和参考。

1 实验部分

1.1 原料与仪器

黄连、苦参、甘草：道地药材，西安葆元堂股份有限公司。将药材放入恒温鼓风干燥机中37 ℃干燥，然后用高速万能粉碎机粉碎并过180 μm筛，放入广口瓶中备用；大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、腐生葡萄球菌：标准菌种，由西安医学院医学信息与技术学院提供。

电子天平：JM-B6002，余姚市纪铭称重校验设备有限公司；旋转蒸发仪：RE-2000A，循环水式真空泵：SHZ-D(Ⅲ)，巩义市予华仪器有限责任公司；高速万能粉碎机：FW-200，北京中兴伟业仪器有限公司；紫外可见分光光度计：WFZ UV-2102PCS，优尼柯(上海)仪器有限公司；电热恒温培养箱：DH-500A，北京中兴伟业仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 活性成分提取

以水为溶剂，采用微波萃取法，提取功率为1 000 W，设定相应提取时间和温度，将提取液抽滤、浓缩，定容到25 mL容量瓶；取上述溶液1 mL，稀释1 000倍，用紫外分光光度计测345 nm处的吸光度，以吸光度的大小作为评价指标。

1.2.2 抑菌性实验

移取提取液1 mL至灭菌离心管中，再将20片直径6 mm灭菌后的滤纸片浸入药液中放入37 ℃干燥箱，挥发除去大部分水后备用。称取33 g营养琼脂，加入1 000 mL蒸馏水中，加热煮沸溶解，在121 ℃、102 MPa灭菌15 min制成培养基，待温度下降至50～60 ℃，在超净台上将制备好的培养液倒入经过同样方法灭菌的培养皿中，放冷、凝固，备用[14]；将所需细菌接种在培养皿中，然后贴上浸有提取液的滤纸片，放入37 ℃培养箱中，培养24 h后观察抑菌圈大小。

1.2.3 响应曲面法优化提取工艺

利用Design-Expert 8.0软件设计并优化提取方案，考察各影响因素之间的交互作用。以提取液最大紫外吸收波长处吸光度为响应值，对提取过程中的提取温度、提取时间、V(水)∶m(原料)(以下简称“液料比”)进行三因素三水平实验设计，共17个实验点(包括5个中心点)。

2 结果与讨论

2.1 提取液最大紫外吸收

将提取液在200～600 nm紫外分光光度计下进行扫描，结果见图1。

λ/nm图1 配伍提取液200～600 nm紫外吸收光谱

由图1可知，药材提取液在紫外波长为345 nm处的峰型较好，且吸收明显。因此，选用波长345 nm对提取液中有效成分含量进行评价。

2.2 配伍比例

不同组方时各提取液的抑菌性实验结果见表1。

表1 抑菌结果1)

续表

由表1可知，m(黄连)∶m(苦参)∶m(甘草)=8∶1∶1，对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌及腐生葡萄球菌均具有较好抑制作用，抑菌圈最大，抑菌效果最好，故确定最佳配比为m(黄连)∶m(苦参)∶m(甘草)=8∶1∶1。

2.3 响应曲面实验

选择提取温度A、提取时间B、液料比C为自变量，以提取液最大吸收波长处吸光度为响应值，采用Box-Behnken实验方法，设计17个实验点，其中12个为析因点，5个为零点实验，以估计误差。实验因素水平及编码、响应面实验结果及方差分析结果分别见表2～表4。

表2 实验因素水平及编码

表3 响应面分析方案及实验结果

续表

表4 方差分析表1)

2.4 各因素之间的交互作用

2.4.1 温度与时间的交互影响

固定液料比C为20∶1，由响应曲面得出提取温度A与提取时间B的等高线图和响应曲面图见图2。

A/℃a 等高线图

b 响应曲面图图2 提取温度与时间的交互影响

由图2可知，提取温度与提取时间的等高线呈椭圆形，表明温度与时间对实验有交互影响，但表4可知AB的P=0.052 4>0.05，表明两者之间交互作用不显著。

2.4.2 温度与液料比的交互影响

固定提取时间B为60 min，由响应曲面得出提取温度A和液料比C的等高线图和响应曲面图见图3。

A/℃a 等高线图

b 响应曲面图图3 提取温度与液料比的交互影响

由图3可知，等高线呈圆形，曲面平缓，表明提取温度与液料比无交互影响。由表4可知AC的P=0.799 6>0.05，表明两者之间交互作用不显著。

2.4.3 时间与液料比的交互影响

固定提取温度A为50 ℃，由响应曲面得出提取时间B和液料比C的等高线图和响应曲面图见图4。

B/mina 等高线图

b 响应曲面图图4 提取时间与液料比对提取率的交互影响

由图4可知，等高线呈椭圆形，表明提取时间与液料比有交互影响。由表4可知BC的P=0.278 8>0.05，因此，两因素之间交互作用对实验结果影响不显著。

2.5 结果验证与抑菌活性评价

精密称取3份药材样品，按优化后的条件进行提取，所得提取液分析结果见表5。

由表5可知，提取液的吸光度平均值为0.785 6，理论预测值为0.789 9，则相对误差为0.5%，相对误差小于3%。因此，采用响应曲面法(RSM)优化得到的提取条件参数准确可靠，具有实用价值。提取液的抑菌结果表明，优化条件下的抑菌效果显著。

表5 验证结果

3 结 论

对黄连、苦参、甘草3种中药材的配伍比例进行优化，采用超声-索氏提取对配伍药材活性成分进行提取，获得m(黄连)∶m(苦参)∶m(甘草)=8∶1∶1，提取液对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、腐生葡萄球菌的抑菌效果最好。对中药的开发利用具有一定的指导意义，为中药复方抑菌处方的研制提供一定的参考。