中国被毛孢提取物及其主要活性成分的抗肿瘤活性*

刘少静，秦 蓓**，余丽丽，姚 琳，康冬妮，何晓佳

(1.西安医学院 药学院，陕西 西安 710021；2.西安医学院 药物研究所，陕西 西安 710021)

恶性肿瘤近年来成为严重威胁人类健康的重要杀手之一，寻找有效的抗癌药物成为世界医学面临的重大课题。目前使用的化疗药物多数存在副作用大、选择性差、成本高等缺点，针对抗肿瘤药物的研发，在提高药效的同时，应提高选择性、降低毒副作用[1-2]。目前从中药中寻找安全、有效的抗肿瘤活性部位及有效单体化合物已成为开发抗癌新药的途径之一[3-5]。中国被毛孢(Hirsutellasinensis)是冬虫夏草的无性型菌株，被公认为是冬虫夏草唯一代表性真菌，具有免疫调节、降血脂、抗衰老、抗疲劳、抗肿瘤和降血糖等多种生物活性[6-9]。其化学成分与天然冬虫夏草成分相似，包括腺苷、尿苷、虫草素等，已有相关研究表明虫草素、中国被毛孢菌丝体多糖等均具有抗肿瘤、增强免疫力的活性[10-14]，但未见相关中国被毛孢提取物及其主要活性成分的抗肿瘤活性进行对比研究的报道。作者采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测中国被毛孢提取物及其主要活性成分虫草素对人乳腺癌细胞ZR-75-30的抑制率，同时针对样品对细胞形态及凋亡情况的影响进行考察。初步对比其抗肿瘤活性，为中国被毛孢制剂及其单体化合物作为癌症辅助治疗手段提供科学依据与临床指导。

1 实验部分

1.1 原料、试剂与仪器

虫草素标准品：HPLC>98%，上海源叶生物科技有限公司；中国被毛孢菌丝体：杭州众芝康菇生物技术有限公司；人乳腺癌细胞ZR-75-30：中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。

MTT：批号为M5655，碘化丙啶(PI)：生化试剂，美国Sigma公司；RPMI-1640培养液：批号为AAK208935，胎牛血清：批号为NZE1145，美国Hyclone科技有限公司；胰蛋白酶溶液：批号为2016062902，w(胰蛋白酶)=0.25%，w[乙二胺四乙酸(EDTA)]=0.02%，吉诺生物医药技术有限公司；二甲基亚砜(DMSO)、无水乙醇等：均为分析纯，市售。

倒置显微镜：Ti-u，日本Nikon公司；CO2恒温培养箱：MCO-15AC，日本Sanyo公司；自动全波长酶标仪：Multiskan go，赛默飞世尔科技(中国)有限公司；冷冻干燥机：FD-1000，旋转蒸发仪：CCA-1111 CE，东京理化器械株式会社；循环水式真空泵：SHZ-D(Ⅲ)，巩义市予华仪器有限责任公司；分析天平：ADVENTURER，奥豪斯仪器有限公司；超净工作台：SW-CJ-1F，苏州安泰空气技术有限公司。

1.2 样品的制备

1.2.1 中国被毛孢提取物的制备

称取中国被毛孢菌粉约20 g，加入φ(乙醇)=75%溶液，于60 ℃回流提取3次，1 h/次。合并3次提取液，减压浓缩除去乙醇；加适量水于浓缩液中，进行分散后冷冻干燥，制得粉末状提取物。

(1)提取物溶液的制备：精密称取1.2.1方法提取物适量，加入DMSO超声溶解，配置1.5 mg/mL储备液，经0.22 μm微孔滤膜过滤除菌，4 ℃储存备用。采用RPMI-1640培养基[φ(胎牛血清)=10%]将提取物储备液稀释成质量浓度为25、50、100、200、400、800 μg/mL溶液。

(2)虫草素溶液的制备：精密称取虫草素适量，配置成1 mg/mL的储备液，过0.22 μm微孔滤膜除菌，4 ℃储存备用。采用RPMI-1640培养液[φ(胎牛血清)=10%]将其稀释成质量浓度为25、50、100、200、400、800 μg/mL溶液。

1.3 细胞培养

将复苏后的乳腺癌细胞ZR-75-30培养于培养基RPMI-1640[φ(胎牛血清)=10%]中，置于37 ℃，φ(CO2)=5%培养箱中培养。根据生长情况换液或消化，取对数生长期的细胞用于实验。

1.4 MTT法检测样品对肿瘤细胞活力的影响

将处于对数生长期的乳腺癌ZR-75-30细胞消化、计数，接种到96孔板中。细胞贴壁后加入不同质量浓度的样品溶液(25、50、100、200、400、800 μg/mL)，

每组设4个复孔，作用24 h后终止培养；每孔加入ρ(MTT)=5 g/L溶液20 μL，37 ℃避光继续培养4 h，弃去上清液，保留结晶物(甲臜)，每孔加入150 μL DMSO，37 ℃振荡15 min溶解甲臜，用酶标仪在490 nm处测定每孔的吸光度(OD)。以不加样品溶液的细胞悬液作为对照组，根据公式(1)计算样品对乳腺癌ZR-75-30细胞抑制率，并采用Origin2018软件进行拟合计算样品对乳腺癌ZR-75-30细胞的半数抑制浓度(IC50)。

(1)

1.5 倒置显微镜观察ZR-75-30细胞的形态

为了直观反映中国被毛孢提取物及虫草素对乳腺癌ZR-75-30细胞的毒性作用，在显微镜下观察细胞形态的变化。取对数生长期的乳腺癌ZR-75-30细胞，以每孔1.8 mL(1.8×105个/孔)接种于6孔板中，培养24 h。待细胞贴壁后，吸弃旧培养基，每孔加入ρ(样品)：25、50、100、200、400、800 μg/mL，溶液2 mL，培养24 h。以相同体积的DMSO溶液代替样品溶液作为对照组，于37 ℃，φ(CO2)=5%的条件下培养12 h，采用倒置显微镜观察细胞形态。

1.6 PI单染荧光检测细胞凋亡

在1.5实验操作的基础上，向6孔板的每孔中加入1 mLρ(PI)=10 μg/mL溶液，避光孵育30 min，弃去上清液，PBS洗涤3次，置于倒置荧光显微镜下观察细胞凋亡情况。

在对我国各建筑工地进行了多次的走访与调查之后，从调查的结果中不难看出，我国现阶段有部分企业对于成本的控制缺乏科学性，存在诸多管理问题。控制方法不科学，其主要原因有管理制度的缺失，企业的实际经济状况与工程预算相脱节等问题。部分企业的成本控制方式仅限于理论，并未能结合实际，属于纸上谈兵，以至于工程的正常施工受到阻碍，成本资金出现浪费问题[2]。除此之外，在工程项目前期的招、投标阶段，相关企业未能理清事实，过分追求经济利益的最大化，致使企业的相关人员对于成本的管控缺少严谨的态度，使之控制缺少科学依据，会降低企业经济效益，不利于其经营。

2 结果与讨论

2.1 样品对乳腺癌ZR-75-30细胞生长增殖的影响

配置不同质量浓度的样品溶液，采用MTT法检测不同质量浓度样品对乳腺癌ZR-75-30细胞活力的影响，并计算样品对乳腺癌ZR-75-30细胞抑制率，结果见图1。

ρ(样品)/(μg·mL-1)图1 不同样品对乳腺癌ZR-75-30细胞的抑制率

由图1可知，经中国被毛袍提取物、虫草素处理乳腺癌ZR-75-30细胞24 h后，抑制率均随着ρ(样品)的增大呈现升高的趋势，即抑制率与ρ(样品)存在依赖关系。

IC50值是抑制率为50%时的ρ(样品)值，IC50值越低，其样品对乳腺癌ZR-75-30细胞的抑制能力越强。采用Origin2018软件拟合计算虫草素和中国被毛孢提取物对乳腺癌ZR-75-30细胞的半数抑制浓度(IC50)，结果见图2。

样品图2 不同样品对乳腺癌ZR-75-30细胞作用24h的IC50

由图2可知，虫草素和中国被毛孢提取物对乳腺癌ZR-75-30细胞的半数抑制浓度(IC50)分别为51.38和180.16 μg/mL，可以看出，不同样品对乳腺癌ZR-75-30细胞的抑制能力大小为虫草素>中国被毛袍提取物。

2.2 乳腺癌ZR-75-30细胞形态观察结果

不同ρ(样品)对乳腺癌ZR-75-30细胞形态的影响见图3～图5。

图3 对照组

a 50 μg/mL

b 200 μg/mL

c 400 μg/mL图4 不同ρ(提取物)对乳腺癌ZR-75-30细胞形态的影响

a 50 μg/mL

b 200 μg/mL

c 400 μg/mL图5 不同ρ(虫草素)对乳腺癌ZR-75-30细胞形态的影响

由图3可知，对照组中的大多数细胞生长状态良好、排列紧密，呈梭形且边界清晰；由图4、图5可知，加药组细胞的形态均随着ρ(药物)增大而发生显著变化，细胞排列逐渐稀疏，出现形态变圆，细胞固缩、体积缩小，贴壁细胞脱落、数量逐渐减少等死亡特征，表明中国被毛袍提取物、虫草素均对乳腺癌ZR-75-30细胞有抑制作用，且呈质量浓度依赖性。

2.3 乳腺癌ZR-75-30细胞凋亡结果

PI荧光染色后呈现的红色荧光数量多少代表了凋亡细胞的数目，不同质量浓度样品对乳腺癌ZR-75-30细胞凋亡影响见图6、图7。

由图6、图7可知，随着ρ(药品)增大，2组凋亡细胞数目均逐渐增多，说明中国被毛袍提取物、虫草素均能够诱导细胞凋亡，且呈质量浓度依赖性，ρ(药品)越大，诱导细胞凋亡能力越强。虫草素诱导乳腺癌ZR-75-30细胞凋亡能力大于提取物。

a 50 μg/mL

b 200 μg/mL

c 400 μg/mL图6 不同ρ(提取物)对乳腺癌ZR-75-30细胞凋亡影响

a 50 μg/mL

b 200 μg/mL

c 400 μg/mL图7 不同ρ(虫草素)对乳腺癌ZR-75-30细胞凋亡影响

3 结 论

(1)采用MTT法检测中国被毛孢提取物、虫草素对人乳腺癌细胞ZR-75-30的生长抑制作用，其IC50值分别为180.16和51.38 μg/mL；

(2)PI单染荧光拍照检测发现2个样品均以浓度依赖方式诱导人乳腺癌细胞ZR-75-30凋亡，虫草素诱导能力大于提取物。提示中国被毛孢提取物、虫草素能够有效抑制人乳腺癌细胞ZR-75-30的生长增殖。