GSDMD、Caspase-4在上皮性卵巢癌组织中的表达及临床意义

王 丹 尹燕娜 裴 燕 孙本红 张淑英 任爱新

新疆军区总医院北京路医疗区(乌鲁木齐，830012)

上皮性卵巢癌是一种妇科常见恶性肿瘤，在卵巢部位肿瘤中占50%以上。由于早期病情隐匿，70%患者就诊时已为晚期，患者5年生存率最高仅40%，与其他妇科恶性肿瘤比较死亡率较高[1]。尽管近年来手术、放化疗等治疗水平有一定提高，患者生存情况仍未得到明显改善。Wang等研究发现，Gasdermin-D(GSDMD)在胃癌组织中表达水平降低，可使细胞外相关信号蛋白上调影响胃癌细胞周期，促进胃癌细胞体内外增殖[2]。有研究表明，二甲双胍诱导GSDMD高表达后细胞焦亡被激活，食管鳞癌患者病情进展受到抑制，可作为放化疗替代治疗手段[3]。Zhu等研究证实，半胱氨酸蛋白酶4(Caspase-4)过表达可抑制乳腺癌细胞增殖和肿瘤发生，可能作为临床治疗乳腺癌靶点[4]。由于GSDMD可由炎性因子Caspase-4激活，特异性参与细胞焦亡细胞凋亡过程[5]，本研究通过检测上皮性卵巢癌组织中GSDMD、Caspase-4蛋白表达情况，探究二者与患者临床病例病理特征及预后关系，以期为临床靶向治疗提供一定思路。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2011年9月—2014年9月本院收治的上皮性卵巢癌患者59例(卵巢癌组)，年龄(53.2±17.5)岁(29～72岁)。纳入标准：①根据国际妇产科联合会国际妇产科联盟(FIGO)诊断标准[6]和世界卫生组织分级标准[7]，经临床及病理切片检查确诊为上皮性卵巢癌。②入组前未进行手术、放化疗等治疗。③临床及随访资料完整。排除标准：①合并其它部位肿瘤；②合并心、肾、肝脏严重不足；③患有严重精神疾病；④妊娠及哺乳期。入组患者根据病理类型分为浆液性癌38例，粘液性癌11例，内膜样腺癌7例，透明细胞癌3例；根据组织学分级分为G1-G2期级26例，G3期级33例；根据FIGO分期分为Ⅰ-Ⅱ期28例，Ⅲ-Ⅳ期31例。另选同期卵巢上皮性囊腺瘤患者47例为良性肿瘤组，年龄(52.83±17.34)岁(28～70岁)；浆液性囊腺瘤32例，黏液性囊腺瘤15例。所有患者均对本研究知情并签署知情同意书。本研究经本院伦理委员会批准同意。

1.2 主要仪器与试剂

免疫组织化学染色试剂盒(德国Roche公司)、鼠抗人GSDMD多克隆抗体(台湾Abnova公司)、鼠抗人Caspase-4多克隆抗体(北京博奥森生物技术有限公司)、羊抗鼠IgG二抗(上海研卉生物科技有限公司)。

1.3 检测方法

1.3.1样本采集术中收集卵巢癌组患者癌组织、癌旁组织(距病灶>5cm)及良性肿瘤组患者瘤组织。经甲醛固定、石蜡包埋后制成4μm厚切片备用。

1.3.2 GSDMD、Caspase-4蛋白表达检测采用免疫组织化学染色法检测组织中GSDMD、Caspase-4蛋白表达水平。严格按照免疫组化染色试剂盒说明书进行操作，最终所得切片在显微镜下观察并采集图像信息。每张切片选取6个高倍镜视野进行阳性细胞计数，GSDMD、Caspase-4蛋白在细胞质、细胞核中呈棕黄色或棕褐色的细胞为阳性细胞。染色结果评分根据阳性细胞染色程度和阳性细胞百分比记分，阳性细胞染色程度不着色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分；阳性细胞百分比<5%为0分，5～25%为1分，25～50%为2分，50～75%为3分，>75%为4分。两项记分相加≤3分为低表达，>3分为高表达。

1.4 随访

卵巢癌组患者经治疗出院后均以电话或复查形式随访5年，时间截止至2019年9月，随访期间无失访。随访期间记录患者生存情况。

1.5 统计学分析

使用SPSS 21.0对数据统计学分析。计数资料用(%)表示，行χ2检验。绘制Kaplan-Meier生存曲线进行生存分析，行Log-rank检验。用Cox回归模型进行危险因素分析，采用向后剔除法，行LR检验。P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1GSDMD、Caspase-4蛋白表达水平

如表1、图1(855页)所示，GSDMD、Caspase-4蛋白主要表达于细胞核、细胞质中。GSDMD、Caspase-4蛋白高表达率卵巢癌组织中最低、良性肿瘤组织居中、癌旁正常组织中最高(均P<0.05)。

表1 不同组织中GSDMD、Caspase-4蛋白表达水平(例)

2.2 卵巢癌组织中GSDMD、Caspase-4蛋白表达与临床病理特征关系

不同GSDMD、Caspase-4蛋白表达水平患者其年龄、肿瘤直径、病理类型、有无腹水等比较均无差异(P>0.05)。组织学分级G3级、FIGO分期Ⅲ-Ⅳ期、淋巴结转移患者GSDMD、Caspase-4蛋白高表达率低于组织学分级G1-G2级、FIGO分期Ⅰ-Ⅱ期、无淋巴结转移患者(P<0.05)。见表2。

表2 卵巢癌组织中各蛋白表达与临床病理特征关系

2.3 卵巢癌组织中GSDMD、Caspase-4表达相关性

如表3所示，上皮性卵巢癌组织中GSDMD与Caspase-4蛋白表达水平呈正相关(P<0.05)。

表3 上皮性卵巢癌组织中GSDMD、Caspase-4蛋白表达水平相关性

2.4 不同GSDMD、Caspase-4蛋白表达水平卵巢癌患者生存分析

经5年随访，GSDMD低表达患者累积生存6例，GSDMD高表达患者累积生存13例，GSDMD低表达组5年总生存率(17.1%)低于GSDMD高表达患者(54.2%)(P<0.05)。Caspase-4低表达患者累积生存8例，Caspase-4高表达患者累积生存11例，Caspase-4低表达组患者5年总生存率(21.1%)低于Caspase-4高表达总生存率(52.4%)。见图2(855页)。

2.5 影响卵巢癌患者不良预后危险因素

如表4所示，Cox回归模型单因素分析显示，组织学分级G3、FIGO分期Ⅲ-Ⅳ期、淋巴结转移、GSDMD低表达、Caspase-4低表达是影响上皮性卵巢癌患者不良预后发生的危险因素(P<0.05)。Cox回归模型多因素分析显示，FIGO分期Ⅲ-Ⅳ期、淋巴结转移、GSDMD低表达、Caspase-4低表达是影响上皮性卵巢癌患者不良预后发生的独立危险因素(P<0.05)。

表4 影响上皮性卵巢癌患者不良预后危险因素分析

3 讨论

上皮性卵巢癌早期患者难以发现或重视，当出现消瘦、食欲减退、腹水增加等症状时病情已进展至晚期。晚期患者经治疗后病情难以控制，死亡率较高[1]。因此探寻上皮性卵巢癌发生发展中调控因子对及时了解患者病情进展、给予有效治疗有一定帮助。

GSDMD属于Gsdermin家族，是细胞焦亡过程中的效应蛋白。炎性细胞因子可诱导GSDMD裂解，使细胞膜形成活性空隙，通过改变细胞膜通透性使细胞裂解死亡[8]。有研究表明，感染性疾病进展中机体可通过激活炎性小体促进GSDMD分解和IL-18等炎性因子成熟，促使细胞膜破裂，达到清除感染细胞、完成免疫应答过程目的[9]。近年来GSDMD在肿瘤疾病进展中意义也多有研究。Yang等研究报道，在子宫内膜癌模型小鼠体内补充氢可通过诱导组织及细胞系中GSDMD过表达激活焦亡通路，抑制肿瘤体积和质量增大[10]。本研究结果显示，上皮性卵巢癌组织中GSDMD蛋白高表达率明显低于卵巢良性肿瘤组织及癌旁正常组织，良性肿瘤组织中GSDMD蛋白高表达率低于癌旁正常组织，与Yang等[10]子宫内膜癌研究趋势一致，提示GSDMD蛋白表达水平变化可能与上皮性卵巢癌发生发展有关。Kambara等研究证实，GSDMD可诱导中性粒细胞和巨噬细胞裂解死亡，发挥抗菌抗炎作用[11]。Teng等研究发现，GSDMD过表达可能受NLRP3炎症小体诱导激活细胞焦亡，抑制非小细胞肺癌细胞增殖、促进凋亡[12]。提示上皮性卵巢癌进展中GSDMD低表达可能与其诱导细胞焦亡减弱有关。本研究还发现，与组织学分级G1-G2级、FIGO分期Ⅰ-Ⅱ期、无淋巴结转移患者相比，组织学分级G3级、FIGO分期Ⅲ-Ⅳ期、淋巴结转移患者GSDMD蛋白高表达率明显降低，提示GSDMD蛋白高表达率降低可能与组织学分级、FIGO分期升高、淋巴结转移等肿瘤进展有关。

Caspase-4属于半胖氨酸蛋白酶家族，与细胞炎症性程序性死亡过程密切相关。有研究报道，脓毒症进展中微生物病原体侵入使机体产生由Caspase-4等组成的炎症小体结构以启动危险信号响应，炎症小体促使感染细胞发生焦亡[13]。Caspase-4在肿瘤进展中也发挥重要作用。有研究报道，结肠癌细胞中Caspase-4表达下调，上调其表达可诱导癌细胞DNA损伤，促进癌细胞凋亡[14]。本研究结果显示，癌旁正常组织、上皮性卵巢良性肿瘤组织、上皮性卵巢癌组织中Caspase-4蛋白高表达率依次显著降低，提示Caspase-4蛋白低表达可能预示上皮性卵巢癌发生，Caspase-4表达下调可能与炎症小体诱导的细胞焦亡减弱、癌细胞侵袭能力增大有关。有研究发现，Caspase-4在原发性肝癌患者血清中低表达，与肿瘤恶性程度和治疗效果有关[15]。本研究结果发现，组织学分级G3级、FIGO分期Ⅲ-Ⅳ期、淋巴结转移患者Caspase-4蛋白高表达率明显低于组织学分级G1-G2级、FIGO分期Ⅰ-Ⅱ期、无淋巴结转移患者，提示Caspase-4蛋白表达下调可能与上皮性卵巢癌患者组织学分级、FIGO分期升高及淋巴结转移发生密切相关。

有研究证实，GSDMD作为Caspase-4底物参与细胞焦亡过程[5]。Shi等研究报道，Caspase-4对GSDMD特异性诱导转化作用是细胞焦亡发生、炎性坏死和程序性坏死的必要途径[16]。Qiao等研究报道，α-NETA可能通过促进GSDMD/Caspase-4转换抑制卵巢上皮细胞增殖分化[17]。本研究结果显示，上皮性卵巢癌组织中GSDMD与Caspase-4蛋白表达水平呈正相关，提示GSDMD与Caspase-4间可能存在相互作用，共同参与上皮性卵巢癌发生发展；GSDMD、Caspase-4低表达组5年总生存率低于GSDMD高表达组，且FIGO分期Ⅲ-Ⅳ期、淋巴结转移、GSDMD低表达、Caspase-4低表达是影响上皮性卵巢癌患者不良预后发生的独立危险因素，进一步提示GSDMD、Caspase-4低表达与肿瘤进展及患者生存率低等不良预后发生有关，可能对临床治疗效果及预后判断有一定帮助。

综上所述，上皮性卵巢癌组织中GSDMD、Caspase-4蛋白高表达率显著降低，与组织学分级G3级、FIGO分期Ⅲ-Ⅳ期、淋巴结转移等肿瘤进展及患者5年总生存率低等不良预后发生密切相关。二者可能存在相互作用，共同参与上皮性卵巢癌进展。但由于本研究方法较为基础，具体机制验证还需进一步探究。