连夏配方颗粒对心肌梗死大鼠心率变异性和炎症反应的影响*

李赛赛，李家立，戴方圆，孟园，李平

1.北京中医药大学第三附属医院，北京 100029； 2.济宁医学院附属医院，山东 济宁 272029

连夏配方颗粒由黄连温胆汤化裁而来，具有清热化痰、宁心安神的功效[7]。前期研究证明，连夏配方颗粒可明显改善心肌梗死大鼠心脏自主神经重构[8]，提高心梗大鼠室颤阈值[9]，有效减少肾上腺素诱导的大鼠心律失常的持续时间[10]。但是对连夏配方颗粒干预心肌梗死后HRV及炎症反应的作用有待进一步研究。

1 材料

1.1 动物SPF级健康雄性SD大鼠90只，体质量200～220 g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，许可证号：SCXK(京)2016-0006。实验得到济宁医学院附属医院伦理委员会批准。饲养环境清洁，室温22～24 ℃，相对湿度45%～65%，自由饮水，普通饲料喂养，光照周期12 h/12 h明暗交替。

1.2 药物及试剂连夏配方颗粒(黄连6 g，姜半夏6 g)(北京康仁堂药业有限公司生产，批号：17025661)；酒石酸美托洛尔片(阿斯利康制药有限公司，批号：190710)。注射用青霉素钠(华北制药股份有限公司，批号：F6032104)；戊巴比妥钠(美国sigma公司，批号：T0894)；白介素-1β(interleukin-1β，IL-1β) 试剂盒(北京索莱宝科技有限公司，批号：SEKR0002)；核因子-κB(nuclear factor-kappa B，NF-κB)试剂盒(江苏酶标生物科技有限公司，批号：MB-6640A)；40 ng·L-1多聚甲醛(北京索莱宝科技有限公司，批号：P1110-100)；伊红染液(武汉赛维尔生物有限公司，货号：G1005)；无水乙醇(国药集团化学试剂有限公司，货号：100092683)；二甲苯(国药集团化学试剂有限公司，货号：10023418)；中性树胶(国药集团化学试剂有限公司，货号：10004160)。

1.3 仪器酶标仪(美国Thermo公司，型号：Multiskan MK3)；脱水机(武汉俊杰电子有限公司，型号：JJ-12J)；包埋机(武汉俊杰电子有限公司，型号：JB-P5)；病理切片机(上海徕卡仪器有限公司，型号：RM2016)；低温离心机(德国Eppendorf公司，型号：5810R)；小动物呼吸机(上海奥尔科特生物有限公司，型号：ALC-V8S)；PowerLab数据采集分析系统(澳大利亚ADinstruments公司，型号：PL3508)。

2 实验方法

2.1 建立心肌梗死模型采用结扎左冠状动脉前降支的方法制备心肌梗死大鼠模型[11-12]。首先，大鼠腹腔注射1%戊巴比妥钠(45 mg·kg-1)进行麻醉，备皮后经气管插管连接小动物呼吸机，在第 3～4肋骨之间逐层开胸，左心耳下2 mm处用5号手术线穿线并结扎左冠状动脉前降支，结扎点以下的心肌搏动减弱，心肌组织变苍白，心电图ST段弓背向上抬高并持续15 min以上作为评判心肌梗死造模成功的标志[13]。假手术组平行操作，但只穿线不结扎。术后腹腔注射青霉素4万单位预防感染。大鼠造模心电图见图1。

图1 心肌梗死模型制备前后Ⅱ导联心电图

2.2 大鼠分组及给药术后24 h，将造模成功的50只大鼠随机分为模型组、连夏配方颗粒(高、中、低剂量)组和美托洛尔组，每组10只，另设假手术组8只。根据等效剂量折算法[14]，实验大鼠连夏配方颗粒高剂量为189.00 mg·kg-1、连夏配方颗粒中剂量为94.50 mg·kg-1、连夏配方颗粒低剂量为47.25 mg·kg-1，假手术组和模型组给予同体积的生理盐水灌胃，每日1次，连续30 d。

2.3 检测指标

2.3.1 HRV检测治疗30 d后，进行HRV检测，具体操作如下：大鼠麻醉后仰卧位固定，采用针行电极插入大鼠左、右后肢及右前肢肌肉，连接PowerLab数据采集分析系统，记录Ⅱ导联心电图。随机选取大鼠安静状态下5 min心电图，通过快速傅立叶变换得到HRV频域指标推测心脏交感神经和迷走神经在调节心脏活动中的紧张性和平衡性[15]，主要包括低频功率(low-frequency power，LF，0.2～0.75 Hz)、高频功率(high-frequency power，HF，0.75～2.5 Hz)及低频功率与高频功率的比值(LF/HF)。其中，HF表示迷走神经活性，LF表示交感神经和迷走神经的共同活动，但更多的受交感神经活性影响，LF/HF水平反映了交感神经和迷走神经支配的均衡性[16]。

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2.3.2 血清炎症因子的检测ELISA试剂盒检测大鼠血清NF-κB、IL-1β水平。

2.3.3 HE染色观察心肌组织病理形态学变化每组随机选择3只大鼠，在心肌梗死边缘区获取心肌组织，①采用40 ng·L-1多聚甲醛溶液固定24 h，石蜡包埋后制成厚度为4 μm的切片；②石蜡切片脱蜡：依次将切片放入二甲苯Ⅰ、Ⅱ各20 min，梯度乙醇逐级下行脱水各5 min，自来水冲洗，用吸水纸擦干周边；③苏木精染色：切片入苏木精染液 3～5 min，自来水洗，分化液分化，自来水洗，并洗涤蓝化；④伊红染色：切片依次入85%、95%的梯度乙醇脱水各5 min，入伊红染液中染色5 min；⑤脱水封片：将切片再次放入梯度乙醇中上行脱水各5 min，放入二甲苯Ⅰ、Ⅱ中透明5 min，中性树胶封片；⑥显微镜镜检，采集图像，在光学显微镜下观察心肌组织病理形态学变化。

3 结果

3.1 大鼠的一般情况假手术组大鼠状态良好，活动自如，进食饮水正常，毛色光滑柔顺，舌苔四肢粉红，呼吸正常；模型组(死亡2只)大鼠状态差，精神萎靡，反应迟钝，进食、饮水减少，易惊吓易激惹，出现抱团、消瘦现象，毛色粗糙、无光泽，舌色紫黯，四肢发绀，仰头呼吸；连夏配方颗粒高剂量组(死亡1只)和美托洛尔组(死亡2只)大鼠较模型组改善明显，进食饮水尚正常，偶见易激惹状态，毛色尚可，舌色红黯；连夏配方颗粒中剂量组(死亡2只)较模型组有所好转，一般状况尚可；连夏配方颗粒低剂量组(死亡2只)精神状态稍差，也可见消瘦、毛色粗糙等。

3.2 大鼠Ⅱ导联心电图与假手术组比较，模型组大鼠心电图出现病理性Q波；与模型组比较，美托洛尔组未见病理性Q波；连夏配方颗粒高剂量组病理性Q波明显减小；连夏配方颗粒中、低剂量组病理性Q波也有减小趋势，但不如连夏配方颗粒高剂量组改善明显。见图2。

注：A：假手术组；B：模型组；C：美托洛尔组；D：连夏配方颗粒高剂量组；E：连夏配方颗粒中剂量组；F：连夏配方颗粒低剂量组图2 各组大鼠的Ⅱ导联心电图

3.3 大鼠HRV的测定与假手术组比较，模型组大鼠LF、LF/HF显著降低(P<0.01)。与模型组比较，连夏配方颗粒高、中、低剂量组和美托洛尔组LF显著提高(P<0.01)，连夏配方颗粒高剂量组LF/HF显著升高(P<0.01)，连夏配方颗粒中剂量组和美托洛尔组LF/HF明显升高(P<0.05)。各组之间HF未见明显差异(P>0.05)。见表1。

表1 各组大鼠HRV结果比较

3.4 大鼠心肌组织病理学变化假手术组大鼠心肌肌束形态完整，纤维结构清楚，细胞核边界清晰；模型组大鼠心梗边缘区心肌细胞肿胀、排列紊乱，部分心肌纤维断裂，细胞核有破裂、溶解消失现象，心肌间质出现大量炎症细胞浸润；连夏配方颗粒高剂量组和美托洛尔组心肌纤维排列较为整齐，细胞核大小均匀，坏死心肌细胞和炎症细胞浸润程度明显减轻；连夏配方颗粒中剂量组心肌纤维结构紊乱，可见少量心肌细胞松散、水肿；连夏配方颗粒低剂量组心肌组织上述病理改变有所减轻，但仍存在部分炎症细胞浸润。见图3。

注：A：假手术组；B：模型组；C：美托洛尔组；D：连夏配方颗粒高剂量组；E：连夏配方颗粒中剂量组；F：连夏配方颗粒低剂量组图3 大鼠心肌组织病理学变化(HE，×400)

3.5 大鼠血清NF-κB、IL-1β水平的测定与假手术组比较，模型组大鼠血清NF-κB、IL-1β水平显著升高(P<0.01)；与模型组比较，连夏配方颗粒高剂量组和美托洛尔组大鼠血清NF-κB、IL-1β 水平显著降低(P<0.01)；连夏配方颗粒中剂量组血清NF-κB、IL-1β具有不同程度的降低(P<0.05，P<0.01)，连夏配方颗粒低剂量组未见明显差异(P>0.05)。见表2。

表2 各组大鼠血清NF-κB、IL-1β水平比较

3.6 HRV与血清NF-κB、IL-1β的相关性分析Pearson相关性分析结果显示，各组大鼠HRV频域指标LF、LF/HF与血清NF-κB、IL-1β呈负相关(P<0.05)，HF与血清NF-κB、IL-1β无相关性(P>0.05)。见表3。

表3 HRV与血清NF-κB、IL-1β的相关性分析

4 讨论

根据《中国心血管健康与疾病报告2019概要》[17]，目前我国冠状动脉粥样硬化性心脏病患者已达1 100万，严重威胁着人们的生命健康，对社会造成沉重的经济负担，已成为重大的公共卫生问题。HRV是目前客观评价心脏自主神经功能状态无创、定量的敏感指标。研究表明，HRV与心力衰竭、恶性心律失常、心肌梗死后猝死等密切相关，早期有效干预对提高HRV具有重要的临床意义[18-19]。

心脏自主神经系统包括交感神经和迷走神经，二者共同构成一个复杂网络，调控心脏泵血功能、心肌电活动稳定性等。发生梗死后，心肌急性缺血缺氧或局部梗死，使心脏节段性自主神经末梢受损，梗死区自主神经坏死，心肌去神经化，而梗死边缘区部分未坏死的神经轴突不均匀过度再生，导致心梗后机体的交感神经活性过度激活、迷走神经活性相对降低[20]。心梗后自主神经功能失衡，对心脏窦房结的调节能力减弱，HRV相关指标LF、LF/HF水平降低，心肌电活动的不稳定性增加，易发生各种恶性心律失常、心源性猝死等危及生命。

冠状动脉粥样硬化性心脏病属于中医学“胸痹”等范畴。随着生活水平提高、精神压力增加等，致使痰浊内生、郁久化热，痰热型冠状动脉粥样硬化性心脏病在当今社会呈增长趋势，临床应重视痰热型冠状动脉粥样硬化性心脏病患者[21]。心主血脉，亦主神明，痰热壅滞，痹阻心脉，扰乱心神，发为胸痹。冠状动脉粥样硬化性心脏病痰热证患者易出现胸闷胸痛、心烦急躁、焦虑失眠、口干口苦、舌红苔黄腻、脉滑数等临床表现，与现代医学自主神经功能失调的诸多症状相符合。王林海等[22]也认为，痰热型冠状动脉粥样硬化性心脏病患者存在交感神经兴奋趋势。研究表明，自主神经系统在“心主血脉”与“心主神明”之间发挥着重要的介导作用[23]。冠状动脉粥样硬化性心脏病痰热证与自主神经功能失调密切相关，自主神经功能失调既是导致冠状动脉粥样硬化性心脏病的重要原因，又是冠状动脉粥样硬化性心脏病的主要病理环节和症状表现[24-25]。因此，冠状动脉粥样硬化性心脏病的治疗不仅要强调心肌灌注不足的改善，更要重视对自主神经功能紊乱的调节。

基于上述观点，李平教授在多年临床经验的基础上，融合国医大师路志正“调脾护心”的学术思想和王永炎院士“毒损脉络”理论，创立了连夏配方颗粒，方中黄连苦寒，清热燥湿、泻火解毒，姜半夏辛温，化痰散结、降逆止呕，二者寒热并用以和阴阳，辛开苦降以调升降，有相辅相成之妙用，全方共奏清热化痰以畅血脉，宁心安神以调神明，达到血脉-神明共治之效，对痰热型冠状动脉粥样硬化性心脏病伴有自主神经功能紊乱患者尤为适宜。

炎症反应在心肌梗死发生发展中具有重要作用[26]。适度的炎症反应有利于机体抵抗病原的侵袭、清除坏死组织、促进损伤修复，但过度的炎症反应加速心血管局部斑块破裂，增加恶性心血管事件。研究发现，自主神经系统与炎症反应关系密切[27]。迷走神经通过“胆碱能抗炎通路”可抑制机体炎症反应[28]，而交感神经因受到神经递质和免疫细胞肾上腺素受体亚型影响对炎症反应具有促炎和抗炎的双向调节作用[29]。同时，炎症反应产物亦可通过中枢和外周神经系统反向作用激活交感神经系统，导致自主神经功能进一步恶化[30]。药理学研究表明，黄连、姜半夏具有显著的抗炎作用[31-32]，改善自主神经紊乱同时减轻机体炎症反应是防治心肌梗死的新领域。本研究结果显示，与模型组比较，连夏配方颗粒高、中剂量组提高心肌梗死大鼠LF、LF/HF，心肌结构排列较为规则，炎症细胞浸润程度明显减轻，血清 NF-κB、IL-1β水平降低，说明连夏配方颗粒可提高心梗大鼠HRV，改善自主神经功能，减轻炎症反应。同时，HRV相关指标LF、LF/HF与血清炎症因子NF-κB、IL-1β水平具有良好相关性。提示连夏配方颗粒可能通过减轻炎症反应调节了心梗大鼠的自主神经功能。

综上所述，连夏配方颗粒可提高心梗大鼠HRV、减轻炎症反应，本研究为临床上从痰热治疗冠状动脉粥样硬化性心脏病自主神经功能失调提供依据，但其具体作用机制尚需深入研究。