HPLC 法测定抗毒合剂中葛根素的含量∗

杜云锋，杜向红△，张 伟，刘 伟，陈 宁

1 河南省人民医院，河南 郑州450008；2 河南中医药大学分析测试中心

中药抗毒合剂是河南省人民医院院内制剂（豫药制字Z04010258），由金银花、连翘、葛根、大青叶、板蓝根和柴胡6 味中药组成。该方为本院著名儿科专家罗致桓主任的临床经验方，具有清热解毒和凉血消肿的功效，主治上呼吸道感染及感冒发热、扁桃体炎、腮腺炎等［1］。其中葛根具有解肌退热、透发麻疹、生津止渴、升阳止泻的作用，葛根素是葛根的主要活性成分之一［2-6］，为更好地控制药品质量，本研究参照相关文献报道［7-10］，采用高效液相色谱法测定其含量，以期为全面有效控制产品质量提供实验依据［11-13］。

1 材料

1.1 仪器Agilent 1260 高效液相色谱仪（四元梯度泵、DAD 检测器，美国安捷伦科技有限公司）；METTLER AE240 十万分之一天平、FA2004A 万分之一天平（上海精科天美科学仪器有限公司）；KQ-500DE 型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；HH-S 型水浴锅（巩义市英峪予华仪器厂）；1810-B 型石英自动双重纯水蒸馏器（江苏大地仪器厂）；ZF-7 型三用紫外分析仪（上海嘉鹏科技有限公司）；DHG-9053A 型电热恒温鼓风干燥箱（上海医用恒温设备厂）；HP8200 型飞利浦电吹风（珠海经济特区飞利浦家适电器有限公司）。

1.2 药品与试剂葛根素对照品（中国食品药品检定研究院，批号：111224）；甲醇为色谱纯；娃哈哈纯净水；其他试剂为分析纯。抗毒合剂（批号：20130110、20130125、20130212）由河南省人民医院提供。所用饮片均购于禹州药材市场，并经河南中医药大学董诚明教授鉴定。本实验所有样品执行标准均为《中华人民共和国药典》2015年版一部。

2 方法与结果

2.1 色谱条件色谱柱：Agilent C18（150 mm×4.6 mm，5 µm）柱；流动相：甲醇-水溶液（23∶77）；检测波长：250 nm；柱温：30℃；流速：1 mL/min；进样量：10 µL。理论板数按葛根素峰计算不低于4000，且分离度大于1.5。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液制备 取葛根素对照品适量，精密称定，置于10 mL 容量瓶中，加30%乙醇制成每1 mL含20µg的溶液，即得。

2.2.2 供试品溶液制备 精密量取抗毒合剂1 mL，置于10 mL 容量瓶中，用30%乙醇定容至刻度，摇匀备用。

2.2.3 阴性溶液制备 按处方配比，取除去葛根的其他药材，按抗毒合剂制法制成合剂，再按供试品溶液制备方法制得阴性样品溶液。

2.3 系统适应性试验精密吸取对照品溶液、供试品溶液及阴性对照品溶液各10µL，注入液相色谱仪中，阴性对照样品在葛根素相应保留时间无色谱峰干扰。见图1—3。

图1 葛根素对照品溶液色谱图

图2 抗毒合剂供试品溶液色谱图

图3 抗毒合剂阴性对照品色谱图

2.4 方法学考察

2.4.1 线性关系考察 精密量取“2.2.1”项下葛根素对照品溶液，分别以4、8、10、15、25 µL 按“2.1”色谱条件进样，以峰面积（Y）为纵坐标，对照品的量（X）为横坐标，绘制标准曲线，得回归方程Y=138.63X-58.954（r=0.9998），表明葛根素在10～62.5µg范围内线性关系良好。见图4。

图4 葛根素的标准曲线图

2.4.2 精密度试验 精密吸取同一对照品溶液10 µL，连续进样6 次，以葛根素峰面积计算，RSD为0.19%，表明仪器精密度良好，见表1。

表1 精密度试验结果（n=6）

2.4.3 重复性试验 取同一批号供试品6 份（批号：20130110），按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，分别精密吸取各供试品溶液10µL，以葛根素峰面积计算，RSD 为1.10%，表明本试验方法重复性良好，见表2。

表2 重复性试验结果（n=6）

2.4.4 稳定性试验 取相同供试品溶液，分别于配制后0、4、8、12、24 h，精密吸取10 µL，测定，结果葛根素峰面积RSD 为2.04%，表明制备溶液在24 h内稳定，见表3。

表3 稳定性试验结果（n=6）

2.4.5 加样回收率试验 取已知含量的同一样品2.5 mL（批号：20130110），用30%乙醇定容至50 mL，精密量取6份，分别加入一定量的葛根素对照品溶液，制备样品溶液，精密吸取10µL，注入液相色谱仪，按“2.1”色谱条件测定。结果见表4。

表4 葛根素回收率试验结果（n=6）

2.5 含量测定取3 个不同批次样品，精密量取，按“2.2.2”项下方法制备供试样品溶液，分别精密吸取样品溶液各10µL，按“2.1”色谱条件测定，根据回归方程计算含量。结果见表5。

表5 含量测定结果 mg/mL

3 讨论

抗毒合剂以金银花、连翘为君药，其中金银花［14］宣散风热，清解血毒，具有广谱抗菌、抗病毒、解热抗炎、利胆保肝、降脂等作用；连翘［15］散结消肿，具有抗菌、抗病毒、抗氧化等作用，两者共奏清热解毒，凉血消肿功效。葛根、大青叶、板蓝根、柴胡为臣药，其中葛根［16］解肌退热、发表透疹；大青叶［17］解毒、凉血、止血，具有抗病原微生物、抗内毒素、抗炎、增强免疫功能等作用；板蓝根［18］凉血消斑、利咽止痛，具有清热解毒、凉血利咽等作用；柴胡解表退热、疏肝解郁、升举阳气。诸药联用主治上呼吸道感染及感冒发热、扁桃体炎、腮腺炎等。已应用于临床数十年，疗效显著。葛根素为葛根发挥功效的主要指标性成分，具有解肌退热、透发麻疹、生津止渴、升阳止泻等作用［19］。

目前对该制剂的研究主要集中在提取工艺和药理作用2 方面。王豫等［20］对金银花、葛根药材进行了提取工艺研究；刘宜生［21］对抗毒合剂进行了急性毒性实验研究。对其质量控制方法按照医院内部制剂手册质量标准进行，仅局限于对其中单一成分绿原酸的薄层鉴别，而无明确的含量测定方法。高效液相色谱法能够较好反映中药整体质量，具有分离效能高、检测灵敏度高、分析速度快、选择性高等特点，而被广泛应用于中药及其制剂的综合宏观分析［22］。

本实验考察了甲醇、乙醇不同浓度对样品进行溶解，结果发现30%乙醇作为葛根素溶媒时分离度好，峰形对称，无杂峰干扰，因此葛根素含量测定时采用30%乙醇作为溶剂。中药制剂成分复杂，各药味之间成分相互干扰，葛根素最大吸收波长为250 nm，但在其检测波长下含量测定时发现峰形拖尾且与相邻峰有干扰，进而对流动相梯度进行了探索，结果以被测成分峰对称性好且分离效果较佳的梯度为最佳梯度。同时分别比较了乙腈-水、甲醇-水以及甲醇-水溶液（23∶77）作为流动相，发现以甲醇-水作为流动相时色谱峰分离度差，且相同成分出峰时间较长，基线较漂；以乙腈-水作为流动相出峰时间缩短，但是基线较漂，且色谱峰有拖尾现象；以甲醇-水溶液（23∶77）作为洗脱溶剂时供试品峰基线较平稳，各色谱峰的分离效果较好，因此采用甲醇-水溶液（23∶77）为流动相。

以上实验结果表明该方法便于操作、分离效果好，专属性好，重现性好，可作为抗毒合剂质量标准的含量测定方法。