miR-92a靶向调控STARD13表达促进前列腺癌DU145细胞侵袭和迁移的实验研究

辛以军 徐蓬永 栾建波

前列腺癌是一种男性常见的恶性肿瘤，近年来其发病率有明显升高趋势[1,2]。随着医学技术的不断发展，虽然在手术、放化疗和内分泌等治疗方面取得了很大进步，但对于发生转移的中晚期患者的治疗效果并不理想[3]。因此，深入了解肿瘤细胞转移的分子机制有利于为前列腺癌治疗提供新的治疗靶点和方向。研究显示，在前列腺癌中部分异常表达的miRNA可通过影响肿瘤细胞生物学功能发挥着重要的抑癌或促癌作用[4,5]。miR-92a是miRNAs家族成员，被证实在胃癌和肺癌等多种肿瘤中异常高表达，且具有促进细胞增殖、侵袭和迁移的作用[6]。有研究指出，miR-92a在前列腺癌中呈现高表达，且其表达水平与肿瘤分期、淋巴结转移等密切相关[7]；尽管miR-92a被证实具有促进前列腺癌细胞增殖及抑制细胞凋亡的作用[8]，但其在前列腺癌细胞侵袭和迁移中的作用及调控机制并不清楚。本研究通过观察miR-92a对前列腺癌DU145细胞侵袭和迁移的影响并探讨其可能的作用机制，旨在揭示miR-92a在前列腺癌转移中的作用，为前列腺癌的发病机制及治疗提供新线索。

1 材料与方法

1.1 材料 miR-92a mimics、miR-92a inhibitor及其阴性对照(广州锐博生物公司)，siRNA-STARD13及其阴性对照(上海吉玛制药公司)，pcDNA3.1-STARD13过表达载体及其空载体(山东维真生物公司)，DMEM培养基(美国Hyclone公司)，胎牛血清和胰蛋白酶(杭州四季青公司)，兔抗人STARD13多克隆抗体(美国Abcam公司)，辣根过氧化酶标记的二抗(北京中杉金桥生物公司)，Transwell小室(美国Corning公司)，Matrigel基质胶(美国Sigma公司)，Trizol试剂和Lipofectamine 2000(美国Invitrogen公司)，PCR引物(上海生工生物工程公司)，双荧光素酶报告基因检测试剂盒、逆转录试剂盒和BCA蛋白浓度测定试剂盒(上海碧云天生物公司)。

1.2 细胞及其培养 人前列腺癌细胞株DU145购于美国ATCC。使用含10%胎牛血清的DMEM培养基在5%CO2、100%湿度和37℃细胞培养箱中常规培养DU145细胞。每2天换液1次，待细胞贴壁后，加入0.25%胰蛋白酶消化传代，待细胞传至第3代后可应用于实验。

1.3 细胞转染 将处于对数生长期的DU145细胞按照2×105个/孔接种至6孔细胞板上，在5%CO2、100%湿度和37℃环境下常规培养；待细胞达60%～70%汇合度时，根据转染试剂Lipofectamine 2000说明书进行瞬时转染。其中，将转染miR-92a mimics、miR-92a inhibitor及其阴性对照的细胞分别标记为miR-92a mimics组、miR-92a inhibitor组、mimics-NC组和inhibitor-NC组；而将转染siRNA-STARD13、pcDNA3.1-STARD13及相应对照的细胞作为siRNA-STARD13组、pcDNA3.1-STARD13组、siRNA-NC组和pcDNA3.1组。转染6 h后，更换新鲜培养基继续培养；待培养48 h 后，收集各组细胞进行后续实验。

1.4 RT-PCR检测miR-92a表达 收集转染48 h后的miR-92a mimics组、miR-92a inhibitor组、mimics-NC组和inhibitor-NC组细胞，采用Trizol法提取细胞总RNA后，使用紫外分光光度计检测RNA的浓度与纯度。将高质量的RNA参照逆转录试剂盒说明书步骤进行逆转录，再将逆转录产物cDNA作为模板，以U6为内参进行PCR扩增，并采用2-ΔΔCt法计算DU145细胞中miR-92a的表达水平。其中，PCR反应条件为先以94℃预变性3 min后，进入40个循环阶段：94℃变性30 s、60℃退火30 s、72℃延伸30 s，循环结束后72℃总延伸6 min。PCR反应引物序列为miR-92a 正向引物：5’-CACCTATATTGCACTTGTCC-3’，反向引物：5’-TGCGTGTCGTGGAGTC-3’；U6正向引物：5’-ACCCTGAGAAATACCCTC-ACAT-3’，反向引物：5’-GACGACTGAGCCCCTGATG-3’。

1.5 MTT检测细胞活力 在96孔板接种各组DU145细胞，每孔1×104个细胞，分别连续培养24、48、72 h后，以20 μl/孔的5 mg/ml MTT溶液37℃孵育4 h，之后每孔加入150 μl/孔的二甲基亚砜37℃震荡培养10 min，采用酶标仪测定DU145细胞490 nm波长处的吸光度值(OD490)，以表示细胞活力。

1.6 Transwell小室实验检测细胞侵袭和迁移 在开展侵袭实验前，以无血清培养基质将Matrigel基质胶按照1∶8比例稀释后均匀地平铺到Transwell小室中的上室中，置于37℃下充分融合凝固(在开展迁移实验前无需该过程)。收集转染48 h后的miR-92a mimics组、miR-92a inhibitor组、mimics-NC组和inhibitor-NC组细胞，以磷酸缓冲液洗涤2次后，加入无血清培养基制成浓度为105个/ml的细胞悬液。在将Transwell小室放入24孔板之前，在24孔细胞板中先加入含血清的培养基600 μl/孔，放入小室后在小室上室中加入200 μl/孔细胞悬液；置于5%CO2、100%湿度和37℃环境下培养24 h后，将小室取出，以棉签小心拭去上室中残留的细胞后，浸入4%多聚甲醛中固定20 min；经0.1%结晶紫染色15 min后，采用显微镜观察穿过滤膜的细胞数，以评价细胞的侵袭或迁移能力。实验重复3次。后续，siRNA-STARD13组、pcDNA3.1-STARD13组、siRNA-NC组和pcDNA3.1组细胞侵袭和迁移能力采用相同方法检测。

1.7 双荧光素酶报告基因实验检测miR-92a与STARD13靶向关系 采用生物信息学软件预测发现miR-92a与STARD13 3’UTR存在互补的结合位点，猜测STARD13可能是miR-92a的潜在靶基因。将STARD13 3’UTR克隆重组至荧光素酶报告基因载体pmirGLO上，作为STARD13-WT质粒；另外，将miR-92a与STARD13 3’UTR的结合位点定点突变后，克隆重组至pmirGLO上，作为STARD13-MUT质粒。参照Lipofectamine 2000说明书将STARD13-WT或STARD13-MUT分别与miR-92a mimics、mimics-NC、miR-92a inhibitor或inhibitor-NC共转染至DU145细胞中，对应miR-92a mimics组、mimics-NC组、miR-92a inhibitor组或inhibitor-NC组。转染48 h后收集各组细胞，并参照双荧光素酶报告基因检测试剂盒说明书步骤检测各组细胞的荧光素酶活性。实验重复3次。

1.8 Western blotting检测细胞中STARD13蛋白表达 向DU145细胞中加入细胞裂解液抽提细胞总蛋白后，采用BCA法检测总蛋白的浓度与纯度。将蛋白样品与等量上样缓冲液混匀后，置于沸水浴中煮沸变性5 min；将变性后的蛋白样品行SDS-PAGE凝胶电泳分离后，电转至PVDF膜上。浸入含5%脱脂奶粉的封闭液中封闭2 h后，以STARD13抗体(1∶1 000)和GAPDH抗体(1∶1 000)4℃孵育过夜；次日，再以辣根过氧化酶标记的二抗(1∶5 000)室温孵育2 h后，暗室中加入化学发光剂显影曝光。以GAPDH为内参，采用凝胶成像系统扫描分析DU145细胞中STARD13蛋白的表达水平。实验重复3次。

2 结果

2.1 转染后前列腺癌DU145细胞中miR-92a的表达水平和细胞活力变化 与mimics-NC组比较，miR-92a mimics组细胞中miR-92a的表达水平明显升高(P<0.05)；与inhibitor-NC组比较，miR-92a inhibitor组细胞中miR-92a表达水平明显降低(P<0.05)。MTT检测结果显示，与mimics-NC组比较，miR-92a mimics组细胞24、48和72 h的细胞活力明显升高(P<0.05)；与inhibitor-NC组比较，miR-92a inhibitor组细胞24 h、48 h和72 h的细胞活力明显降低(P<0.05)。见表1。

表1 4 组细胞中miR-92a 表达水平和细胞活力的比较

2.2 miR-92a对前列腺癌DU145细胞侵袭和迁移的影响 Transwell小室检测结果显示，与mimics-NC组比较，miR-92a mimics组细胞侵袭和迁移能力均明显增强(P<0.05)；与inhibitor-NC组比较，miR-92a inhibitor组细胞侵袭和迁移能力均明显减弱(P<0.05)。见表2。

表2 4 组细胞侵袭和迁移能力的比较

2.3 miR-92a靶基因预测及验证 TargetScan软件预测结果显示，miR-92a和STARD13之间存在互补的结合位点；双荧光素酶报告基因实验检测结果显示，与相应对照mimics-NC组或inhibitor-NC组比较，miR-92a mimics能够使转染STARD13-WT质粒细胞的荧光素酶活性降低，而miR-92a inhibitor能够使其荧光素酶活性升高(P<0.05)；此外，Western blotting检测结果显示，与相应对照组比较，miR-92a mimics可使DU145细胞中STARD13蛋白表达水平明显降低，而miR-92a inhibitor则使STARD13蛋白表达水平明显升高(P<0.05)。见图1，表3。

图1 miR-92a和STARD13靶向关系的验证;A miR-92a和STARD13之间存在互补的结合位点；B Western blotting检测STARD13蛋白表达电泳图

表3 4 组细胞荧光素酶活性和STARD13 蛋白表达水平的比较

2.4 STARD13对前列腺癌DU145细胞活力、侵袭和迁移的影响 Western blotting检测结果显示，与siRNA-NC组比较，siRNA-STARD13组细胞中STARD13蛋白表达水平明显降低(P<0.05)；与pcDNA3.1组比较，pcDNA3.1-STARD13组细胞中STARD13蛋白表达水平明显升高(P<0.05)。MTT检测结果显示，与siRNA-NC组比较，siRNA-STARD13组细胞24、48和72 h的细胞活力明显升高(P<0.05)；与pcDNA3.1组比较，pcDNA3.1-STARD13组细胞24、48和72 h的细胞活力明显降低(P<0.05)。Transwell小室实验结果结果显示，siRNA-STARD13组细胞侵袭和迁移能力均明显高于siRNA-NC组，而pcDNA3.1-STARD13组细胞侵袭和迁移能力均明显低于pcDNA3.1组(P<0.05)。见图2，表4。

图2 Western blotting检测 STARD13蛋白表达电泳图

表4 4 组细胞中 STARD13 蛋白表达水平和细胞活力、侵袭、迁移能力比较

3 讨论

前列腺癌预后不良是患者死亡的重要因素，而癌细胞浸润和转移是导致患者预后不良的关键，而肿瘤细胞侵袭和迁移是导致癌细胞转移的重要生理过程；因此，深入研究和了解前列腺癌细胞发生侵袭和迁移的分子机制对更好的治疗前列腺癌具有重要意义。miRNAs是一类不编码蛋白质且进化上高度保守的小分子RNA，其转录本长度约为22个氨基酸，可通过与mRNA互补配对结合调控mRNA表达，在细胞增殖、侵袭和迁移等过程中发挥着重要作用，与包括前列腺癌内在的多种肿瘤的发生发展密切相关[9]，例如miR-139[10]、miR-9[11]和miR-451[12]等。作为miRNAs家族中的一员，miR-92a异常表达也可通过影响细胞侵袭和迁移参与肿瘤的恶性进展。本研究针对miR-92a在前列腺癌中的功能和机制进行评估，结果表明，miR-92a在前列腺癌进展中充当重要的癌基因，促进前列腺癌细胞的活力、迁移与侵袭。并且，miR-92a的这些作用是通过靶向前列腺癌细胞中的STARD13基因来实现的，这可能有利于寻找新的前列腺癌的诊断和治疗策略。

miR-92a已被证明与肿瘤的发生发展紧密相关，例如Yu等[13]在骨肉瘤中发现，miR-92a可通过靶向调控DKK3表达促进癌细胞增殖、侵袭和迁移；Li等[14]报道指出，食管鳞癌中异常高表达的mR-92a可通过靶向调控PTEN表达促进肿瘤细胞侵袭和迁移。尽管，陈晓博[8]研究指出，miR-92a在前列腺癌中表达上调，且发挥着促增殖和抑凋亡的重要作用，但其在前列腺癌转移中的作用并不清楚。因此，本研究在前列腺癌DU145细胞中成功上调miR-92a表达后发现，DU145细胞活力、侵袭和迁移能力明显增强；而下调miR-92a表达后DU145细胞侵袭和迁移能力明显减弱。结果表明，miR-92a可促进前列腺癌DU145细胞活力、侵袭和迁移。这提示miR-92a在前列腺癌细胞增殖和转移过程中发挥着重要的促进作用，与前人研究一致，为miR-92a作为促癌因子参与前列腺癌进程提供了新的证据。

本研究采用生物信息学软件对miR-92a的潜在靶基因进行预测，最终将STARD13作为研究对象。STARD13又名DLC2，定位于13q12.3染色体上，是一种新发现的抑癌基因，其在多种肿瘤中低表达或缺失，在细胞增殖、侵袭和迁移等过程中发挥中重要的调控作用[15]。本研究预测到miR-92a与STARD13之间存在互补的结合位点，同时双荧光素酶报告基因实验证实miR-92a可与STARD13靶向结合降低细胞的荧光素酶活性；此外，上调miR-92a表达可使前列腺癌DU145细胞中STARD13蛋白表达水平降低，而下调miR-92a表达则使STARD13蛋白表达水平升高。这些结果表明，STARD13是miR-92a的靶基因，miR-92a可负向调控其表达。Chen等[16]研究指出，STARD13在前列腺癌中表达下调，而上调其表达可抑制肿瘤细胞侵袭和迁移。本研究成功上调STARD13表达后发现，前列腺癌DU145细胞侵袭和迁移能力明显减弱，而下调STARD13表达后前列腺癌DU145细胞侵袭和迁移能力明显增强，这与Chen等[16]的报道相符。另外，上调STARD13表达后可以抑制前列腺癌DU145细胞活力，下调时具有相反的效果。该结果进一步证实了STARD13具有抑制前列腺癌细胞增殖和转移的作用。这些结果提示，miR-92a促进前列腺癌转移的分子机制与其靶向调控STARD13表达有关。

综上所述，miR-92a可通过靶向调控STARD13促进前列腺癌DU145细胞侵袭和迁移。该结果进一步揭示了miR-92a在前列腺癌发生发展中的作用，也为以miR-92a为靶点的前列腺癌基因治疗提供了新的参考依据。