番石榴叶总三萜对脓毒症大鼠急性肾损伤的治疗及对PI3K/AKT通路的调控

宋银雪 高烨 许静 杜俊凯

创伤、感染、休克等均可并发脓毒症，而该病属于一种全身炎性反应综合征，可损伤肺、心、肾等重要脏器，甚至可诱发多脏器功能衰竭综合征，进而致死。有报道显示，全球每年约有1 900万人口新发脓毒症，其中脓毒症并发急性肾损伤者占比为30.5%～65.0%，且在脓毒症并发急性肾损伤者中死亡率为50%～70%[1,2]。但是目前临床上对脓毒症并发急性肾损伤患者仍缺乏高效的治疗方案，虽然乌司他丁等有一定的肾脏保护作用[3]，但综合效果不甚理想。番石榴叶总三萜是番石榴叶中提取的有效成分，其中含有丰富的乌苏酸、积雪草酸等，在既往的研究中证实该药物具有肾脏保护作用[4]，但是在脓毒症并急性肾损伤中的有效性尚未可知。磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)通路是常用的炎性反应通路，该通路激活可影响其下游核因子-2-相关因子-2(Nrf2)基因与蛋白的表达，使得促炎性因子水平释放量显著增加，从而诱发急性肾损伤[5,6]。故此，本研究特设计大鼠试验探讨番石榴叶总三萜对脓毒症大鼠急性肾损伤的治疗作用，并从基因和蛋白水平上探讨该药物可能的调控机制，报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物 60只成年SD大鼠，无特定病原体级，雌雄各半，均属同系，7～9周龄，体重180～220 g，购自广西医科大学实验动物中心，合格证号：SCXK(桂)2018-0001。将所有SD大鼠分笼喂养，适应性喂养1周，喂养条件：自由饮食和进水，温度(25±2)℃，湿度30%～50%，光照12 h、黑暗12 h，光照和黑暗交替进行。

1.2 试剂与仪器 乌司他丁(购自美国Roche公司)；番石榴叶总三萜(购自温州东匝津玛生物科技有限公司，纯度≥98%)；水合氯醛溶液(购自上海经科化学科技有限公司)；鼠血清肌酐(Scr)、血尿素氮(BUN)酶联免疫法(ELISA)检测试剂盒(购自上海江莱生物科技有限公司)；鼠白介素-1β(IL-1β)、白介素-18(IL-18)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)ELISA检测试剂盒(购自上海江莱生物科技有限公司)；苏木素-伊红(HE)染色试剂盒(购自大连宝生物科技有限公司)；Trizol试剂盒(购自大连宝生物科技有限公司)；目的基因和内参上下游引物委托大连宝生物科技有限公司合成；蛋白定量试剂盒(购自美国ABI公司)；兔抗鼠PI3K、AKT、Nrf2、磷酸化PI3K(p-PI3K)、磷酸化AKT(p-AKT)单克隆抗体、山羊抗兔PI3K、AKT、Nrf2、p-PI3K、p-AKT多克隆抗体(均购自美国Bio-Rad公司)。LA500型离心机(购自湖南湘仪仪器厂)；AU5600型全自动生化分析仪(购自美国贝克曼库尔特有限公司)；KD-3368AM型组织切片机(购自上海之信仪器有限公司)；11XB-PC型光学显微镜(购自上海光学仪器一厂)；7500型聚合酶链反应系统(美国ABI公司)；

1.3 方法 分组、建模、干预方法：自60只SD大鼠中随机选取50只建立脓毒症模型，具体方法：术前常规禁食禁饮，均于上午8∶00～10∶00开始手术建模。首先以水合氯醛溶液(5%)腹腔注射进行麻醉，剂量6 ml/kg，于大鼠腹部做正中切口，长度约1 cm，确认盲肠将其拉出，在总长度的1/2位置结扎，以针头(18G)在结扎线下5 mm位置处刺孔，将盲肠回纳至原位置，关闭腹腔。剩余10只记为BC组，操作与上述方法一致，但无结扎、穿刺步骤。将建模大鼠随机分为MC组、PC组、LD组、MD组和HD组，PC组予以20万U·kg-1·d-1乌司他丁腹腔注射，LD组、MD组和HD组予以60、120和240 mg·kg-1·d-1番石榴叶总三萜腹腔注射，连续1周。

1.4 观察指标

1.4.1 血清肾功能和炎性反应指标检测方法：其中肾功能指标包括血清Scr、BUN，炎性反应指标包括血清白介素-1β(IL-1β)、IL-18、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)，分别于给药前后取尾静脉血于真空抗凝管中，2 000 r/min 离心10 min，取上清液采用ELISA检测，注意严格按照试剂盒和全自动生化分析仪说明书操作。

1.4.2 肾组织病理改变检测：干预后断头法处死大鼠，迅速剥离新鲜的肾脏组织，以中性甲醛溶液固定，漂洗，梯度浓度乙醇脱水，并常规进行透明、透蜡处理。石蜡包埋，根据组织块大小进行修整，切片，层厚设置为4 μm。HE染色，洗涤并显色，中性树胶封固后在光学显微镜下观察肾组织病理变化。

1.4.3 肾组织PI3K、AKT、核因子-2-相关因子-2(Nrf2) mRNA表达检测：采用实时荧光定量RT-PCR方法，具体：同法取肾组织，按照Trizol试剂盒说明书提取总RNA，逆转录合成为cDNA。根据NCBI基因库信息查询目的基因的mRNA序列，设计上下游引物，其中PI3K上游引物：5’-ACTCGATAGCTAGATCGATAGCTATAGCTAG-3’，下游引物：5’-CTGAGCTAGAGCTAGAGTTGCTAGATCGAGT-3’，长度均为18 bp；AKT上游引物：5’-TAGCTAGATCGGCTCGATAGCTAGAGGACTAG-3’，下游引物：5’-ATCGATAGCTATATATATGCTAGATGATC-3’，长度均为18 bp；Nrf2上游引物：5’-TCGATAGCTAGAGCTAGAGCTAGATCAGA-3’，下游引物：5’-ATCGATAGCTAGATCGATAGAGAGGAGATCGATG-3’，长度分别为18 bp、20 bp；内参β-actin上游引物：5’-GATAGAGAGAGGAGATGAGAGCTGAATGCATAG-3’，下游引物：5’-TAGCTAGAGATAGAGAGTCGATAGACTAGATCGA-3’，长度均为20 bp。配置反应体系，进行扩增，流程：95℃(20 s)，35个循环：78℃(90 s)、58℃(30 s)，最后52℃(5 min)。以配套的检测系统分析软件采集荧光信号，绘制溶解曲线，计算2-ΔΔCt即为待检测基因的相对表达量。

1.4.4 肾组织PI3K、AKT、Nrf2蛋白表达及p-PI3K、p-AKT水平检测：采用蛋白质免疫印迹法(WB)检测。同法取肾组织，于冰上匀浆并裂解，提取总蛋白，取20 μl 样品电泳，以转膜仪转膜处理，封闭孵育一抗(4℃，过夜)，次日洗膜后以膜与辣根过氧化酶标记的抗IgG抗体孵育，室温摇床孵育2 h，再次洗膜后可显影。采用配套的图像分析系统对条带灰度值进行分析，内参为β-actin。

2 结果

2.1 给药前后血清肾功能指标变化 建模和实验期间BC组无死亡，MC组、PC组、LD组、MD组和HD组分别有4只、2只、3只、2只、2只大鼠死亡，均剔除本研究。给药后BC组血清Scr、BUN水平均无明显变化(P>0.05)，MC组均较给药前显著升高(P<0.01)，其余4组均较给药前显著下降(P<0.01)，且给药前MC组、PC组和3剂量组均高于BC组(P<0.01)，给药后MC组均显著高于BC组(P<0.05)，PC组和3剂量组均显著低于MC组(P<0.01)，PC组、MD组和HD组均显著低于LD组(P<0.01)，HD组均显著低于PC组、MD组(P<0.01)。见表1。

表1 给药前后血清肾功能指标变化

2.2 给药前后血清炎性反应指标变化 给药后BC组血清IL-1β、IL-18、TNF-α水平均无明显变化(P>0.05)，MC组均较给药前显著升高(P<0.01)，其余4组均较给药前显著下降(P<0.01)，且给药前MC组、PC组和3剂量组均高于BC组(P<0.01)，给药后MC组均显著高于BC组(P<0.05)，PC组和3剂量组均显著低于MC组(P<0.01)，PC组、MD组和HD组均显著低于LD组(P<0.01)，HD组均显著低于PC组、MD组(P<0.01)。见表2。

表2 给药前后血清炎性反应指标变化

2.3 肾组织病理变化 BC组肾小球体积和形态均正常、肾曲小管上皮细胞排列整齐、均匀；MC组肾小球体积显著增大，大多肾曲小管上皮呈严重浊肿变性，细胞浆内可见较多红染颗粒细胞，且可见多个小灶状小管坏死，甚至有部分管腔内可见明显管型；LD组肾小球体积明显增大，较多肾曲小管上皮呈中重度浊肿变性，细胞浆内可见多数红染颗粒细胞，可见部分小灶状小管坏死，有部分管腔内可见管型；PC组和MD组肾小球体积增大，部分肾曲小管上皮呈轻中度浊肿变性，细胞浆内可见部分红染颗粒细胞，且部分小灶状小管坏死，有少部分管腔内可见管型；HD组肾小球体积轻微增大，少量肾曲小管上皮呈轻度浊肿变性，细胞浆内可见极少红染颗粒细胞，少部分小灶状小管坏死，极少量管腔内可见管型。见图1。

BC组MC组PC组

LD组MD组HD组

2.4 肾组织PI3K、AKT、Nrf2 mRNA相对表达量检测 6组肾组织PI3K、AKT mRNA相对表达量对比差异均无统计学意义(P>0.05)；6组肾组织Nrf2 mRNA相对表达量对比，MC组显著高于BC组(P<0.01)，PC组和3剂量组均显著低于MC组(P<0.01)，且PC组、MD组和HD组均显著低于LD组(P<0.01)，HD组显著低于PC组和MD组(P<0.01)。见表3。

表3 肾组织PI3K 、AKT 、Nrf2 mRNA 相对表达量

2.5 肾组织PI3K、AKT、Nrf2蛋白相对表达量及p-PI3K、p-AKT水平检测 6组肾组织PI3K、AKT蛋白相对表达量对比差异均无统计学意义(P>0.05)；6组肾组织Nrf2 蛋白相对表达量、p-PI3K、p-AKT水平对比，MC组均显著高于BC组(P<0.01)，PC组和3剂量组均显著低于MC组(P<0.01)，且PC组、MD组和HD组均显著低于LD组(P<0.01)，HD组均显著低于PC组和MD组(P<0.01)。见图2，表4。

图2 肾组织PI3K、AKT、Nrf2蛋白相对表达量及p-PI3K、p-AKT水平(WB)

表4 肾组织PI3K 、AKT 、Nrf2 蛋白相对表达量及p-PI3K 、p-AKT 水平

3 讨论

脓毒症主要是由感染所致，在严重烧伤、外科手术、多发伤、免疫力低下、重症肺炎等患者中，可随着疾病的进展出现脏器损伤甚至是器官功能衰竭，最终致死[7]。国内外研究均证实在脓毒症患者及实验动物模型中均可出现不同程度的急性肾损伤，且炎性反应严重，因此减轻肾损伤、改善肾功能和控制炎性反应均是脓毒症的重要治疗任务[8,9]。

本次研究结果中给药前与BC组相比，其余5组肾功能指标和炎性反应指标均显著升高，提示脓毒症大鼠造模成功，且已经出现急性肾损伤；给药后BC组肾功能指标、炎性反应指标均无明显改变，而MC组给药后血清Scr、BUN、IL-1β、IL-18、TNF-α水平均显著升高，PC组和3剂量组给药后均显著下降，且均低于MC组，提示乌司他丁、番石榴叶总三萜均可减轻脓毒症大鼠的肾损伤程度，控制炎性反应，且HD组均低于PC组和MD组，证实高剂量的番石榴叶总三萜的作用明显优于乌司他丁。有研究发现，该药物可改善糖尿病大鼠的肾功能[10]；另有研究指出，番石榴叶总三萜可控制糖尿病大鼠体内高血糖状态所致的炎性反应[11]。与本研究结果相符，推测该药物很可能具有减轻脓毒症大鼠急性肾损伤、控制炎性反应的作用。在本研究病理学观察结果中显示，MC组肾组织呈严重病理改变，PC组和3剂量组肾组织病变均有所减轻，且HD组的效果最佳，证实番石榴叶总三萜具有减轻脓毒症大鼠急性肾损伤的作用，显示出良好的挖掘价值。

PI3K/AKT信号通路可参与炎性反应、氧化应激损伤等多种病理改变，是炎性反应的经典调控通路，且已经被认为是脓毒症急性肾损伤治疗的靶点[12]。本研究中，各组肾组织PI3K、AKT mRNA及蛋白相对表达量差异无统计学意义(P>0.05)，而MC组肾组织Nrf2 mRNA及蛋白相对表达量、p-PI3K、p-AKT水平均较BC组显著升高，PC组和3剂量组均较MC组显著下降，且HD组均明显低于MC组和MD组，可知番石榴叶总三萜、乌司他丁均可通过调控脓毒症大鼠肾组织PI3K/AKT信号通路，进而抑制p-PI3K、p-AKT水平、下调Nrf2的表达，推测番石榴叶总三萜很可能是通过该通路发挥保护肾脏、减轻炎性反应的作用的。PI3K/AKT可调控细胞自嗜，进而影响细胞凋亡，当该通路被激活，p-PI3K、p-AKT水平可显著升高，激活其下游Nrf2的表达，促进脓毒症大鼠肾脏细胞的自嗜和凋亡，同时该信号通路激活可促进IL-1β、IL-18和TNF-α等促炎性因子的分泌和释放，引发炎性反应[13]。有报道显示，通过抑制脓毒症大鼠肾组织PI3K/AKT信号通路可减少IL-18的分泌和释放，降低血清、肾组织中炎性因子的含量[14]。另有研究指出，PI3K/AKT信号通路激活还可增强炎症小体的活性，进而加重炎性反应，诱导脏器损伤[15]。因此结合本研究结果和上述分析，推测番石榴叶总三萜很可能是通过调控PI3K/AKT信号通路，进而抑制p-PI3K、p-AKT水平、下调Nrf2的表达减轻脓毒症大鼠模型急性肾损伤病理变化的，且其作用呈剂量依赖性。

综上所述，番石榴叶总三萜可改善脓毒症大鼠的肾功能，减轻炎性反应和肾组织病理损伤，且其作用呈明显的剂量依赖性，高剂量的番石榴叶总三萜的作用显著优于乌司他丁，推测该药物是通过调控PI3K/AKT信号通路抑制p-PI3K、p-AKT水平、下调Nrf2的表达实现肾脏保护作用的。本研究为脓毒症急性肾损伤患者的治疗提供了新方向，但如何将其应用于临床及其可行性、安全性，该药物是否具有其它调控机制等问题仍需深入研究探讨。