ACHBLF患者外周血中NK与NKT细胞的变化及与肝功能和细胞因子的关系

程涛 伍伟玲 钟宋 黄河

慢加急性乙型肝炎肝功能衰竭(acute-on-chronic hepatitis B liver failure，ACHBLF)的病情发展迅速、肝功能在短时间内发生恶化，患者的预后较差且死亡率较高[1,2]。目前，ACHBLF的发病机制仍未完全明确，HBV在肝细胞内持续复制虽然会直接引起肝细胞变性、坏死，进而造成慢性乙型肝炎病程中不同程度的肝损伤，但单纯依靠HBV复制无法完全解释慢性乙型肝炎病程向急性肝衰竭的进展。近年来，免疫应答紊乱与ACHBLF发生的关系受到了越来越多的关注，肝脏内免疫细胞的浸润及活化、多种细胞因子的分泌是ACHBLF发生的重要诱因[3,4]。自然杀伤细胞(natural killer cells，NK细胞)和自然杀伤T细胞(natural killer T cells，NKT细胞)是体内重要的非特异性免疫细胞，已有研究证实，肝衰竭动物模型中肝脏NK细胞及NKT细胞进入增多、杀伤活性增强[5]。在下列研究中，我们具体分析了ACHBLF患者外周血中NK与NKT细胞的变化及其意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择2015年6月至2018年8月南部战区空军医院感染科诊断为ACHBLF的45例患者作为ACHBLF组，诊断为慢性乙肝的58例患者作为CHB组。ACHBLF患者符合中华医学会《肝衰竭诊疗指南2018版》[6]，CHB均符合《慢性乙型肝炎防治指南2019版》[7]，排除合并其他类型肝炎病毒感染的患者、入组前3个月内接受过抗病毒治疗的患者以及诊断为原发性肝癌的患者。另取同期在南部战区空军医院体检中心体检的50例健康志愿者作为研究的对照组。ACHBLF组中男26例，女19例；年龄26～48岁；CHB病程9～18年；CHB组中男32例，女26例；年龄24～51岁；CHB病程9～16年；对照组中男28例，女22例；年龄25～50岁。3组受试者一般资料比较差异无统计学意义(P>0.05)。

1.2 研究方法

1.2.1 外周血免疫细胞含量检测方法:取新鲜的外周血0.1 ml，立即进行免疫细胞检测，加入荧光标记的CD3、CD56单克隆抗体，4℃避光孵育30 min后加入2 ml 红细胞裂解液(1∶10稀释)，室温避光孵育10 min，离心后取沉淀并加入FACS缓冲液洗涤、离心1次，最后用200 μl FACS缓冲液重悬细胞，在流式细胞仪上测定CD3-CD56+NK细胞及CD3+CD56+NKT细胞的含量。

1.2.2 血清生化指标检测方法:取外周血后离心，分离血清并在-80℃保存。检测是，采用全自动生化分析仪测定丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、γ-谷氨酰转肽酶(γ-GT)、总胆红素(TBIL)、直接胆红素(DBIL)、间接胆红素(IBIL)的含量，采用酶联免疫吸附试剂盒测定肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、干扰素-γ(IFN-γ)、白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-8(IL-8)、白细胞介素-32(IL-32)、CC亚族趋化因子配体20(CCL20)、高迁移率族蛋白B1(HMGB1)的含量。

2 结果

2.1 外周血中NK细胞及NKT细胞的含量 ACHBLF组和CHB组患者外周血中NK细胞及NKT细胞的含量均显著低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，ACHBLF组患者外周血中NK细胞及NKT细胞的含量均显著低于CHB组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 3 组受试者外周血中NK 细胞及NKT 细胞比较

2.2 血清中肝功能指标的含量 ACHBLF组和CHB组患者血清中ALT、AST、γ-GT、TBIL、DBIL、IBIL的含量均显著高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，ACHBLF组血清ALT、AST、γ-GT、TBIL、DBIL、IBIL的含量均显著高于CHB组(P<0.05)。见表2。

表2 3 组受试者血清中肝功能指标比较

2.3 血清中炎性因子的含量 ACHBLF组和CHB组患者血清中TNF-α、IFN-γ、IL-6、IL-8、IL-32、CCL20、HMGB1的含量均显著高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，ACHBLF组患者血清中TNF-α、IFN-γ、IL-6、IL-8、IL-32、CCL20、HMGB1的含量均显著高于CHB组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

2.4 相关性分析 Pearson检验分析ACHBLF组患者外周血中NK细胞、NKT细胞含量与血清肝功能指标、炎症细胞因子含量的相关性，ACHBLF组患者外周血中NK细胞、NKT细胞含量与血清中ALT、AST、γ-GT、TBIL、DBIL、IBIL、TNF-α、IFN-γ、IL-6、IL-8、IL-32、CCL20、HMGB1的含量呈负相关(P<0.05)。见表4。

表3 3 组受试者血清中炎症细胞因子比较

表4 外周血中NK 细胞、NKT 细胞与血清肝功能指标、炎性因子的相关性

3 讨论

NK细胞及NKT细胞是参与固有免疫应答的免疫细胞，已有研究证实，肝衰竭动物模型中肝脏NK细胞及NKT细胞进入增多、杀伤活性增强[5]。本研究证实，ACHBLF组和CHB组患者外周血中NK细胞及NKT细胞的含量均显著降低且ACHBLF组患者外周血中NK细胞及NKT细胞的含量均显著低于CHB组，与动物实验中NK细胞及NKT细胞的变化吻合，说明在CHB向ACHBLF发展的病程中，患者外周血中NK细胞和NKT细胞的含量呈降低趋势，这可能与NK细胞和NKT细胞在肝脏内浸润的增多有关。

NK细胞和NKT细胞在肝脏内的浸润能够杀伤HBV并抑制HBV复制[10,11]，但是，过度激活和浸润的NK细胞和NKT细胞具有极强的促炎活性，在杀伤HBV的同时能够持续造成肝细胞的破坏，最终发展为肝衰竭[12-14]。本研究分析证实，ACHBLF组和CHB组患者血清中各项肝功能指标均显著升高且ACHBLF组患者血清中各项肝功能指标均显著高于CHB组。这就说明在CHB向ACHBLF发展的病程中，患者的肝功能不断恶化。进一步通过相关性分析发现：ACHBLF组患者外周血中NK细胞、NKT细胞含量与血清中肝损伤指标呈负相关。说明ACHBLF组患者外周血中NK细胞、NKT细胞含量的降低以及肝脏中NK细胞、NKT细胞的浸润与肝功能的恶化有关。

NK细胞和NKT细胞在肝脏内所介导的促炎效应是造成肝损害的重要环节，多种炎性因子在环节中大量分泌[15,16]。本研究的分析发现，ACHBLF组和CHB组患者血清中TNF-α、IFN-γ、IL-6、IL-8、IL-32、CCL20、HMGB1的含量均显著升高且ACHBLF组患者血清中上述细胞因子的含量均显著高于CHB组。上述细胞因子具有促炎、促进细胞因子趋化等活性[17-21]，结合细胞因子的生物学功能分析，在CHB向ACHBLF发展的病程中，炎性反应的激活程度不断加剧。进一步通过相关性分析发现：ACHBLF组患者外周血中NK细胞、NKT细胞含量与血清中TNF-α、IFN-γ、IL-6、IL-8、IL-32、CCL20、HMGB1的含量呈负相关。这就说明ACHBLF组患者外周血中NK细胞、NKT细胞含量的降低以及肝脏中NK细胞、NKT细胞的浸润能够直接激活炎性反应、促进多种炎性细胞因子的分泌，进而通过炎症细胞因子的生物学效应来引起肝细胞损害、造成肝衰竭的发生。

综上所述，在CHB向ACHBLF发展的过程中，患者外周血中NK与NKT细胞含量的减少且与肝功能恶化、炎性反应激活密切相关，由此也提示ACHBLF肝脏内NK与NKT细胞的大量浸润和激活能够造成肝细胞损害以及炎性因子的大量分泌。