突发性耳聋患者血清miR-431、Eya4表达与耳蜗功能的相关性研究

鲍靖

突发性耳聋是临床上耳鼻喉科较常见急症，该疾病主要是指患者在72 h内突然发生不明原因的感音神经性听力受损，且出现至少两个频率听力下降为20 dBHL的一种疾病[1,2]。突发性耳聋患者以单侧发病较为多见，少数患者为双侧发病，患者常伴有不同程度的眩晕、耳鸣等症状，严重影响患者的生活质量，同时也造成极大的痛苦[3]。微小RNA-431(microRNA-431，miR-431)是存在于生物体内的一种非编码小RNA，研究显示，miR-431在多种疾病中发挥重要作用[4,5]。Eya4(Eye absent 4)是eya家族的成员之一，相关研究显示，Eya4基因突变与遗传性耳聋密切相关[6,7]。然而，目前血清miR-431、Eya4的表达与突发性耳聋的发病机制及其与耳蜗功能的关系尚不完全清楚。基于此，本研究拟通过检测突发性耳聋患者血清miR-431、Eya4的表达情况，探究其表达水平与突发性耳聋患者耳蜗功能的关系，以期为临床诊断及治疗突发性耳聋提供有价值的参考依据，报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2018年11月至2020年1月本院耳鼻喉科收治的突发性耳聋患者65例为突发性耳聋组，男37例，女28例；年龄21～60岁。同期选取在本院进行常规体检的健康人群70例为对照组，男39例，女31例；年龄20～61岁。2组性别比、平均年龄、体质量指数(body mass index，BMI)、舒张压及收缩压比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。该研究经本院道德伦理委员会批准通过，样品采集均取得患者及家属知情并签署同意书，且符合《世界医学协会赫尔辛基宣言》。见表1。

表1 2 组基本资料比较

1.2 纳入与排除标准 纳入标准：(1)符合2005年制定的《突发性耳聋的诊断和治疗指南》中有关突发性耳聋的相关诊断标准[8]；(2)患者及家属选择在本院进行治疗者；(3)临床资料完整者。排除标准：(1)同时患有心、肾、肝功能不全者；(2)由于外耳和中耳疾病等因素所致的耳聋者；(3)由于大前庭水管综合征等病因所致的听力下降者。

1.3 主要试剂与仪器 离心机(货号：wi82487)，购自于北京若水合科技有限公司；总RNA提取试剂盒(货号：20310)，购自于北京甘棠飞华生物科技有限公司；逆转录试剂盒(货号：AORT-0020)，购自于上海伯易生物科技有限公司；实时荧光定量PCR仪(货号：V115896)，购于美国Applied Biosystems公司；miR-431、Eya4以及内参U6引物，由上海杏园瑞民生物工程有限公司合成；本研究中其他化学药品均购自上海锐塞生物技术有限公司。

1.4 方法

1.4.1 样品采集及保存:血清样品：于清晨抽取所有受试者空腹状况下的静脉血4 ml，3 000 r/min(4℃)离心分层后收集上层血清，置于-20℃冰箱中保存待测。

1.4.2 血清miR-431、Eya4表达水平检测:采用实时荧光定量PCR法(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)检测2组研究对象血清miR-431、Eya4的表达水平。具体操作步骤：取出待测血清，用总RNA提取试剂盒并严格按照说明书顺序提取总RNA，然后经逆转录得到cDNA。以逆转录合成的cDNA为模板，进行qRT-PCR检测。PCR反应条件：94℃，2 min；94℃，30 s；60℃，30 s；74℃，35 s，共40个循环。采用2-ΔΔCT法计算血清miR-431、Eya4相对表达量。

1.5 耳蜗功能评定 患者入院后由专门医生对其耳蜗功能进行诊断，若患者蜗性听力下降或损失为耳蜗功能异常，反之耳蜗功能正常。

2 结果

2.1 2组研究对象血清miR-431、Eya4表达水平 突发性耳聋组血清miR-431表达水平显著高于对照组(P<0.05)；血清Eya4表达水平显著低于对照组(P<0.05)。见表2。

表2 2 组血清中miR-431 、Eya4 表达水平

2.2 血清miR-431、Eya4对突发性耳聋的诊断价值 ROC结果显示，血清miR-431、Eya4诊断突发性耳聋的AUC分别为0.795、0.746，截断值分别为1.234、0.990，此时对应灵敏度分别为72.3%、87.7%，特异性分别为80.0%、57.1%。血清miR-431、Eya4联合检测突发性耳聋的AUC为0.811，此时对应灵敏度和特异性分别为73.8%、78.6%。见表3，图1。

表3 血清miR-431 、Eya4 表达水平对突发性耳聋诊断价值比较

图1 血清miR-431、Eya4对突发性耳聋的诊断价值

2.3 血清miR-431、Eya4表达与患者耳蜗功能的关系 以血清miR-431、Eya4的截断值将突发性耳聋患者分组，其中高miR-431组39例，低miR-431组26例；高Eya4组29例，低Eya4组36例。高miR-431组患者耳蜗功能异常发生率明显高于低miR-431组(P<0.05)；高Eya4组患者耳蜗功能异常发生率显著低于低Eya4组(P<0.05)。见表4。

表4 4 组患者耳蜗功能的比较 例(%)

2.4 影响突发性耳聋患者耳蜗功能的相关因素分析 以突发性耳聋患者耳蜗功能异常是否发生为因变量(0=否，1=是)，血清miR-431、Eya4表达水平为自变量，采用Logistic回归分析，结果显示：血清miR-431高表达、Eya4低表达是影响突发性耳聋患者发生耳蜗功能异常的独立危险因素(OR=3.142,95% CI：1.161～8.504；OR=0.020,95% CI：1.146～4.924,P<0.05)。见表5。

表5 突发性耳聋患者耳蜗功能异常的危险因素分析

3 讨论

突发性耳聋以无明显原因、突然发生为临床特征。该疾病的主要临床表现为患者听力下降，同时伴有眩晕、恶心呕吐、耳鸣、耳堵塞感等[9,10]。目前90%左右的突发性耳聋患者病因不明，给治疗带来一定困难，且对患者预后造呈严重影响[11]。因此，对其发病理机制进行深入研究，以寻找新的疾病标志物，对早期诊断及治疗具有重要的临床意义。

miR-431是位于14q32 miRNA基因簇中的一种小分子RNA，相关研究显示，miR-431主要分布于骨骼肌中，在骨骼肌分化、再生等多种生物学活性中发挥重要作用[12,13]。沈艳青等[14]通过探究miR-431在肺发育形态学中的潜在作用，结果发现，miR-431在肺发育过程中可能起重要的负向调控作用。Yang等[15]研究发现，miR-431在子痫前期胎盘中高表达，可能通过靶向ZEB1抑制了滋养细胞的迁移和侵袭，引起子痫前期发作。本研究结果显示突发性耳聋组血清miR-431表达水平显著高于对照组，提示miR-431可能参与突发性耳聋的发展进程，但有待进一步证实。

Eya4是一种编码转录激活因子相关蛋白，位于6q23.2上，由640个氨基酸组成[16,17]。Eya4在胚胎发育过程中发挥重要作用，且其突变与扩张型心肌病、多种恶性肿瘤及遗传性耳聋等密切相关[18,19]。吴楷文等[6]研究发现，目前世界范围内报道与耳聋相关Eya4的18种致病突变中，多数引起Eya4翻译被提前终止，是Eya4下调，导致患者出现听觉障碍。樊悦[20]研究发现，miR-431高表达可能通过抑制靶基因Eya4的翻译，使Eya4蛋白形成受阻，进一步影响螺旋神经节细胞分化，最终导致听力障碍。本研究结果显示，突发性耳聋组血清Eya4表达水平显著低于对照组，提示可能由于miR-431高表达抑制了Eya4的形成进而参与突发性耳聋的发生发展。本研究中ROC曲线分析表明，血清miR-431、Eya4诊断突发性耳聋的AUC分别为0.795、0.746，提示血清miR-431、Eya4可作为评估突发性耳聋发生的指标，且miR-431表达水平对突发性耳聋的诊断价值较Eya4高。进一步分析发现，两者联合检测突发性耳聋的AUC为0.811，提示两者联合诊断价值高于单独诊断。本研究还发现，高miR-431组患者耳蜗功能异常发生率明显高于低miR-431组，高Eya4组患者耳蜗功能异常发生率显著低于低Eya4组，提示血清miR-431高表达、Eya4低表达与突发性耳聋患者耳蜗功能密切相关。此外，Logistic回归分析结果显示：血清miR-431高表达、Eya4低表达为突发性耳聋患者发生耳蜗功能异常的独立危险因素，提示监测两者表达水平，对评估突发性耳聋患者发生耳蜗功能异常有一定的临床价值。

综上所述，miR-431在突发性耳聋患者血清中的表达水平明显升高，Eya4表达水平明显降低，两者对突发性耳聋具有一定诊断价值，且其表达水平与患者耳蜗功能异常密切相关，提示血清miR-431、Eya4可作为评估突发性耳聋患者病情及耳蜗功能的潜在生物学指标，但其具体的作用机制还有待深入研究。