应用流式细胞术检测胃癌移植瘤小鼠脾脏中MDSC及T淋巴细胞亚群的变化

李 南，曾凡业，仝梦婷，节阳华，轩艳红，张洪亮

（新疆医科大学第四附属医院肿瘤二科，新疆 乌鲁木齐 830000）

胃癌（gastric cancer）是消化道最常见的恶性肿瘤，其死亡率约占所有癌症死亡率的20%～30%，一般患者的5 年生存率小于20%，且大多预后较差[1]。目前胃癌的致病机制尚不明确，认为肿瘤细胞可能通过促进免疫细胞凋亡或抑制其功能从而获得免疫逃逸。传统治疗方案如手术、放疗及化疗未能明显改善患者的预后生存，但随着对胃癌生物分子学机制的不断深入研究，肿瘤免疫治疗可能为胃癌治疗方案提供新的思路。髓性抑制细胞（myeloid-derived suppressor cells，MDSC）是一种异质性细胞，主要来源骨髓组细胞和未成熟髓细胞。研究发现[2，3]，大量MDSC 积聚在荷瘤小鼠脾脏、血液及肿瘤组织或存在肿瘤患者的外周血及肿瘤组织中。正常的免疫应答反应是机体抵抗肿瘤细胞形成和发展的重要保护因素，其中CD8+T 细胞介导的细胞免疫反应尤为突出。在肿瘤微环境中，活化的MDSC 可通过直接或间接作用发挥免疫抑制作用，产生免疫逃逸反应，从而使肿瘤逃避机体的自身免疫监视体系，促进肿瘤发展[4]。本研究建立小鼠胃癌皮下移植瘤模型，利用流式细胞术检测荷瘤小鼠脾脏中CD4+和CD8+T 细胞以及MDSC 和调节性T 细胞（Treg）的数量及相关比例变化，并分析其相关T 淋巴细胞的增值和凋亡反应，探讨MDSC 在胃癌免疫逃逸中可能的作用机制，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 健康6～8 周龄C57BL/6J 小鼠30只，购自中国医学科学院医学实验动物研究所[许可证号：scxk（京）2019-0011]，在新疆医科大学大学实验动物中心饲养。本实验设计经动物实验伦理审核。

1.1.2 细胞株 小鼠前胃癌细胞株（mouse forestomach carcinona cell，MFC）购自于中科院上海生命科学院。

1.1.3 仪器及试剂 红细胞裂解液，Fc 受体阻断剂（2.4G2），相关流式抗体（BV421 标记大鼠抗小鼠CD25；BV605 标记大鼠抗小鼠CD8a；Alexa FluorTM647 标记大鼠抗小鼠；Foxp3 APC-cy7 标记大鼠抗小鼠CD11b。FITC 标记大鼠抗小鼠CD4；PE 标记大鼠抗小鼠Gr-1；PE-cy7 标记大鼠抗小鼠CD3），活力染料FVS510，荧光补偿微球及膜联蛋白-V（Annexin-V）凋亡染色试剂盒、5-溴脱氧尿嘧啶核苷（BrdU）细胞增殖检测试剂盒均购自美国BD bioscience 公司。流式细胞仪为CytoFLEX 和流式数据分析软件为Kaluza 2.0 均购自美国Beckman Coulter公司。

1.2 方法

1.2.1 造模消化 收集对数生长期的MFC 细胞，PBS洗涤2 次后，用PBS 制成细胞悬液，台盼蓝染色活细胞比例大于95%，并进行细胞计数，调整细胞浓度为1×107/ml。采用随机数字表法将30 只小鼠分成正常组和荷瘤组，每组15 只。对小鼠右侧背部皮肤进行常规酒精消毒后，荷瘤组小鼠注射取0.2 ml 的MFC 细胞悬液，正常组小鼠注射等量的生理盐水。

1.2.2 免疫细胞表面抗原染色 肿瘤形成约2 周后采用颈椎脱臼法处死小鼠，分离脾脏并将其制成单细胞悬液，加入Fc 受体阻断剂2.4G2，4 ℃下封闭10 min，然后加入活力染料FVS510（1∶1000 稀释），室温下孵育15 min。用细胞缓冲液洗涤2 遍后加入滴定的细胞表面抗体混合液，总反应体系为50 μl，4 ℃下避光孵育10 min，细胞缓冲液清洗两遍后上机检测。采用FMO 作为阴性对照，细胞凋亡检测按照说明书操作。

1.2.3 细胞内染色 制备脾脏单细胞悬液，在进行细胞表面抗原染色后，染色缓冲液洗涤2 次后，加入100 μl 细胞固定/打孔液，混匀后4 ℃下避光放置20 min。2 次细胞固定/打孔缓冲液洗涤后，用100 μl细胞固定/打孔缓冲液重悬后，加入滴定的Foxp3 抗体，4 ℃下避光孵育30 min。细胞固定/打孔缓冲液洗涤2 次后上机检测。

1.2.4 细胞增殖检测 小鼠24 h 腹腔内注射BrdU 溶液，1 mg/只，连续注射3 d。在处死小鼠制成脾脏单细胞悬液后，先进行细胞表面染色，细胞经固定，破膜后加入DNase（1×107/ml），37 ℃下避光孵育60 min，加入荧光素标记的BrdU 单克隆抗体染色，采用流式细胞仪进行检测分析。

1.3 统计学方法 采用SPSS 17.0 统计软件进行数据分析，计量资料以（）表示，组间比较采用t检验。将α=0.05 设为检验水准。

2 结果

2.1 胃癌MFC 荷瘤小鼠肿瘤形成情况 胃癌移植瘤接种小鼠后，第6 天可在体外触及约黄豆大小肿块，约第17 天后肿块显著增大，其与正常组小鼠相比，荷瘤组小鼠开始出现不同程度的消瘦、竖毛、蜷缩、精神萎靡、懒动、活动量减少，成瘤率为100.00%。

2.2 荷瘤小鼠脾脏中MSDC 和Treg 细胞变化 在流式数据分析中，应用4 个基本的二维散点图以消除上样分析样本的碎片、死细胞，粘连体和不稳定的细胞流见图1。与正常组相比，荷瘤组MDSC 占脾细胞的比例和数量升高，差异有统计学意义（P＜0.05）；荷瘤组CD3+CD4+CD25+Foxp3+Treg 细胞比例及数量较正常组升高，差异有统计学意义（P＜0.05），见图2、表1。

表1 两组小鼠脾脏中MDSC 和Treg 细胞比例及数量比较（）

表1 两组小鼠脾脏中MDSC 和Treg 细胞比例及数量比较（）

图1 粘连体和不稳定的细胞流

图2 小鼠脾脏中MDSC 和Treg 细胞

2.3 荷瘤小鼠脾脏中CD4+和CD8+T 细胞变化 荷瘤组小鼠脾脏中CD4+和CD8+T 细胞所占脾细胞比例和数量低于正常组，差异有统计学意义（P＜0.05），见图3、表2。

表2 两组小鼠脾脏中CD4+和CD8+T 细胞比例及数量比较（）

表2 两组小鼠脾脏中CD4+和CD8+T 细胞比例及数量比较（）

图3 小鼠脾脏中CD4+和CD8+T 细胞

2.4 荷瘤小鼠脾脏中CD4+和CD8+T 细胞凋亡率与增值率变化 荷瘤组CD4+T 细胞凋亡率高于正常组，但差异无统计学意义（P＞0.05）；荷瘤组小鼠脾脏CD8+T 细胞凋亡比例高于正常组，且CD4+和CD8+T细胞增值率低于正常组，差异有统计学意义（P＜0.05），见图4、表3。

表3 两组小鼠脾脏中CD4+和CD8+T 细胞凋亡率与增值率比较（，%）

表3 两组小鼠脾脏中CD4+和CD8+T 细胞凋亡率与增值率比较（，%）

图4 小鼠脾脏中CD4+和CD8+T 细胞凋亡率与增值率

3 讨论

肿瘤的发生与发展常伴随着机体自身的免疫功能异常变化，且主要体现在各种功能性免疫细胞数量或功能的改变。体内多种免疫细胞可杀伤或清除肿瘤细胞，但传统T 细胞仍发挥着至关重要作用，其中CD8+效应性T 细胞可释放穿孔素或颗粒酶，分泌肿瘤坏死因子α（TNF-α）及表达膜型FasL 等机制直接杀伤肿瘤细胞，而CD4+效应性T 细胞可释放Th1 型细胞因子，促进CD8 的细胞毒性杀伤机制[5]。然而，在机体抗肿瘤免疫应答过程中，肿瘤细胞却能逃避机体免疫系统的攻击或抑制传统T 细胞免疫应答，从而导致肿瘤细胞在体内进行性生长。MDSC和Treg 细胞可发挥免疫抑制作用，其中人MDSC 定义为CD33+CD11b+HLA-DRlow/-，小鼠MDSC 定义为Gr1+CD11b+[6]，而Treg 是一群细胞表面高表达CD25，胞内高表达Foxp3 转录因子的CD4+T 细胞亚群。肿瘤部位的MDSC 可分泌白介素-10（IL-10）和转化生长因子-β（TGF-β）等抑制免疫应答，而Treg细胞可通过细胞直接接触和分泌IL-35 和TGF-β等细胞因子抑制T 效应细胞增殖[7，8]。

MDSC 是免疫抑制网络中主要的细胞群，其是由早期髓源祖细胞、非成熟粒细胞、单核细胞以及不同分化阶段的树突状细胞组成，可存在于肿瘤患者外周血和大量积聚在荷瘤宿主外周淋巴和肿瘤组织中[6]。本研究采取MFC 小鼠背部注射制备胃癌小鼠模型，主要观察荷瘤小鼠脾脏中各种淋巴细胞的变化，结果显示荷瘤小鼠脾脏中MDSC 和Treg 细胞较正常组升高，而CD4+和CD8+T 细胞比例和数量却呈下降趋势（P＜0.05），其原因可能为这两类淋巴细胞的增殖能力明显降低，且CD8+T 细胞的凋亡能力显著升高。此外，MDSC 的大量增殖和激活能诱导一氧化氮合酶，精氨酸酶和活性氧的表达，从而导致精氨酸的加速分解和一氧化氮的大量合成，而精氨酸的缺乏会阻滞T 细胞的分化和增殖，且一氧化氮的积聚会抑制IL-2 受体下游信号蛋白，从而抑制T 细胞活化，并激活Fas-FasL 途径促进T 细胞凋亡[9，10]。此外，CD8+T 细胞Fas 表达的增加，也会增强肿瘤组织MDSC 和Treg 诱导凋亡的敏感性。

总之，胃荷瘤小鼠脾脏中MDSC 和Treg 细胞比例和数量增加，而具有抗肿瘤细胞作用的CD4+和CD8+T 细胞数量降低，增殖受阻和凋亡增加，提示肿瘤形成和发展过程中机体免疫功能的复杂变化，且主要表现为抑制肿瘤作用减弱，促进肿瘤进展因素增强。因此，如何扭转这一免疫功能变化，将会为临床胃癌患者的治疗提供新的方向，但具体免疫细胞在肿瘤微环境中所起的作用仍需进一步研究阐明。