汞中毒模型建立及中药干预试验

黄精贵 黄小娟 梅金钰 黄鸥飞 李文仕

摘要：目的 探讨中药绿豆及其复方海尔福清千口服液对汞中毒小鼠于预效果的实验研究。方法 用小白鼠复制汞中毒动物模型，然后用中药灌胃干预，测定各种指标.用氯化汞（HgCl2）注射小鼠腹腔染毒，2周，然后用绿豆水提取液及其复方海尔福清千口服液灌胃干预2周.测定染毒前后及干预后的血红蛋白含量;实验结束，取血分离血清测定，处死小鼠，取大脑，制备10%匀浆待测.其余器官肝，肾，生殖器，用甲醛浸泡送病理研究（另文）.结果下面按1绿豆组，2清千组，3模型组，4正常组，依次排列，血红蛋白（Hb）含量，染毒前：各组间比较，F=1.605，p=0.203，差异无统计学意意义。染毒后：依次排列146.28±19.40▲▲a164.39±13.95▲★a152.26±31.94▲▲c183.63±16.96★★各组间比较，F=6.369，p=0.001，差异有统计学意意义;中药干预后，依次排列为121.61±13.53▲▲b137.52±15.41▲▲★b145.43±19.17▲▲★★b171.13±17.12★★中药干预后：各组间比较，F=16.635，p=0.001，差异有统计学意意义;脑（chAT）活力，26.00±8.82★★69.91±35.52★▲78.98±24.89★▲122.42±45.36▲▲：F=8.853，P=0.001，差异有统计学意意义;脑（GSH-PX）活力，142.89±23.38★★126.48±8.11▲113.75±15.82▲▲149.71±22.93★★差异有统计学意意义;脑超氧阴离子自由基（）清除率%，汞中毒明顯下降;结论 综合分析，汞中毒小鼠，血红蛋白、体重、大脑部分与记忆相关的关键酶活力，均明显下降;中药干预后有一定恢复，以海尔福清千口服液更显著一些。

关键词：汞中毒 ; 小鼠 ; 绿豆; 海尔福清千口服液 ; 干预

【中图分类号】R995 【文献标识码】A 【文章编号】1673-9026（2021）08-014-02

汞在工业上有重要的用途，据报导统计有3000多种，但在工业生产过程中容易造成环境污染，是环境污染主要毒物之一。汞中毒损害机体重要器官，如肾脏，造血系统，生殖系统，神经系统，等[1]。本实验主要探讨汞对记忆有关的关键酶活性的影响，以及中药具有解毒作用的绿豆及其复方制剂对其干预治疗作用的探讨。现将结果报导如下。

1. 试剂与方法：

1.1试剂. 乙酰胆碱酯酶（AchE）测试盒、乙酰胆碱转移酶（chAT）测试盒、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX），测试盒、甘油三酯、总胆固醇、尿素氮测定试剂盒、总蛋白测定试剂盒。1-奈胺、盐酸羟胺、对氨基苯磺酸、盐酸（HCL）、高铁氰化钾、氰化钾、无水磷酸二氢钾、碳酸氢钠，过硫酸铵， 氯化汞，均为国产分析纯。

1.2中药绿豆干品，购自市面，制取流程：称取中药放锅内 加自来水20倍加热煮沸40分钟过滤加热浓缩冷却 加3倍量v/v95%乙醇沉淀过夜过滤弃沉淀回收乙醇药液定容装瓶105℃高压消毒30 分钟 . 常温，保存待用。复方海尔福清千口服液由广西云球生物科技有限公司研发部提供， 由绿豆、银花、茯苓、甘草.等组成[2].

1.3动物， 小白鼠40只，昆明种（SPF级），健康，雌雄各半，鼠龄40天平均体重30克。购自湖南省长沙市天勤生物技术有限公司， 物生产许可证号：SCXK（湘）209-0014. 质量检测单位， 湖南省动检二站，动物实验单位：右江民族医学院，使用许可证号：SYXK桂2011-0010。）.放空气净化鼠架装置内，分笼喂养，每笼6只，雌雄分开，由学院动物室提供用标准饲料喂养，自由饮用自来水。

1.4实验方法：

用健康小白鼠40只，分成4组，（1）、（2）、（3）为造模组，另设（4）为正常对照组.每组10只.用100mg/dl浓度HgCl2水溶液给小鼠腹腔注射染毒[3]，每日一次，染毒 10 天后， （1绿豆组）、（2清千组）组开始分别用中药绿豆提取液和海尔福清千口服液（绿豆、银花、茯苓、甘草复方液）作灌胃干预，以成人量折算， 剂量为0.1mL/只，每日一次，（3模型组）、（4正常对照组）组用等体积的蒸馏水灌胃，连续实验30日结束.测定染毒前， 染毒后，中药灌胃干预后血红蛋白（Hb）. 结束从眼球后取血， ，分离血清， 测定生化指标：血清甘油三酯、总胆固醇、尿素氮、总蛋白参照文献说明书测定;处死小鼠，取出大脑，称重，在冷冻下研磨， 用生理盐水制备10%脑组织匀浆，离心3000rpm，10min，后取上清液，放冰箱备用。

1.5测定方法

血红蛋白（Hb）测定采用氰化高铁血红蛋白（HiCN）法，参照文献[3]。测定脑匀浆乙酰胆碱酯酶（AchE）、乙酰胆碱转移酶（chAT）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX），活力。Tc用COD-CE-PAP测定;TG用GPO-OAO法测定;尿素氮用脲酶波氏法测定;AchE根据乙酰胆碱在AchE催化下产生乙酸和胆碱，胆碱再与巯基显色剂作用产生黄色化合物TNB（对称三硝基苯），比色测定;具体操作按试剂盒说明书;清除率测定利用比色法[6]，其原理： 由A液中三羟甲基氨基甲烷（Tris）、四甲基乙二胺（TEMED）与B液中过硫酸铵混合后，产生氧自由基（），经盐酸羟胺、对氨基苯磺酸、1-奈胺等连续反应， 产生一种黄色产物， 可以比色测定。具体操作参考文献[4]。乙酰胆碱转移酶（chAT）测定是以乙酰辅酶A和胆碱为底物，在chAT催化下，反应的生成物与显色剂结合，在324nm处有吸收峰，以此测定并计算chAT活力. 具体操作按试剂盒说明书。

1.6 统计学处理 用SPSS软件（13.0版）统计，多组均数比较采用方差分析，两两比较采用LSD法，检验水准为a=0.05。结果用（）表示。

2.结果

2.1一般情况.共用小鼠40只， 雌性 20 只，雄20只，4组每组10只. 绿豆组死亡2只， 模型组死亡2只， 清千组和正常对照组无死亡。

2.2染毒前， 染毒后，中药灌胃干预后小鼠血红蛋白（Hb）含量测定结果。 结果显示，组间比较， 染毒前，小鼠血红蛋白（Hb） 各组间差异无统计学意义。染毒后，正常组明显高于其他各组， 差异有统计学意义。中药干预后， 正常组明显高于其他各组， 差异有统计学意义。见表1。

方差分析：组间比较;血红蛋白Hb， 染毒前：各组间比较， F=1.605， p=0.203， 差異无统计学意意义。染毒后： 各组间比较， F=6.369， p=0.001，与正常组比较， ▲P<0.05， ▲▲P<0.01; 与绿豆组比较， ★P<0.05， ★★P<0.01差异有统计学意意义。中药干预后： 各组间比较， F=16.635， p=0.0010，与正常组比较， ▲P<0.05， ▲▲P<0.01; 与绿豆组比较， ★P<0.05， ★★P<0.01; 差异有统计学意意义。

组内染毒前 、染毒后、中药干预后（前中后）比较;绿豆组（前中后）比较，F=32.267， p=0.000，与中药干预后比较，a P<0.01; 与染毒后比较，b P<0.01; 差异有统计学意意义。清千组（前中后）比较，F=26.473， p=0.000，与中药干预后比较，a P<0.01; 与染毒后比较，b P<0.01; 差异有统计学意意义。模型组（前中后）比较，F=6.208， p=0.006，与染毒前比较，c P<0.05; b P<0.01; 差异有统计学意意义。正常组（前中后）比较，F=2.155， p=0.135，差异无统计学意意义。

2.3脑乙酰胆碱酯酶（AchE），乙酰胆碱转移酶（chAT）， 脑谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）活力测定结果. 结果显示， 脑乙酰胆碱酯酶（AchE）， 组间比较： 差异无统计学意意义; 乙酰胆碱转移酶（chAT）， 组间比较： 差异有统计学意意义; 脑（GSH-PX）活力， 组间比较： 差异有统计学意意义; 见表2。

方差分析：组间比较： 脑乙酰胆碱酯酶（AchE）活力：F=0.269，P=0.847， 差异无统计学意意义。; 脑（chAT）活力， ：F=8.853，P=0.001， 与正常组比较， ★P<0.05， ★★P<0.01; 差异有统计学意意义; 与绿豆组比较， ▲P<0.05， ▲▲P<0.01， 差异有统计学意意义; 脑（GSH-PX）活力，与正常组比较， ▲P<0.05， ▲▲P<0.01; 与模型组比较， ★★P<0.01; 差异有统计学意意义;

2.4脑超氧阴离子自由基（）清除率%、血清超氧阴离子自由基（）清除率%，血清总蛋白测定结果. 结果显示， 脑超氧阴离子自由基（）清除率%、组间比较： 差异有统计学意意义; 血清超氧阴离子自由基（）清除率%， 组间比较： 差异无统计学意意义;，血清总蛋白， 组间比较：，差异有统计学意意义.见表3.

方差分析：组间比较： 脑自由基（）（清除率% ）：F=42.14，P=0.000， 与正常组比较，▲▲P<0.01， 与清千组比较， ★★P<0.01， 差异有统计学意意义; 血清自由基（）（清除率% ）， 组间比较： F=2.883，P=0.061差异无统计学意意义; 血清总蛋白， F=10.585，P=0.000， 与正常组比较， ★★P<0.01， 差异有统计学意意义;

2.5小鼠血清甘油三酯（TG）、总胆固醇（TC）、尿素氮含量测定结果. 结果显示，组间比较， 血清甘油三酯，差异有统计学意义; 总胆固醇（TC）， 差异无统计学意义; 尿素氮，差异有统计学意义。见表5 。

方差分析：方差分析：TG， 各组间比较，F=9.474，p=0.000， 与正常组比较，▲▲P<0.01， 差异有统计学意义; 总胆固醇（TC）， 各组间比较，F=0.449，p=0.685， 差异无统计学意义; 尿素氮， 各组间比较，F=2.742，p=0.056，与清千组比较，★P<0.05， 差异有统计学意义;

2.2染毒前、染毒后、中药干预后小鼠体重测定结果. 结果显示， 造模前、治疗前，各组间差异无统计学意义， 治疗后，各组间比较， 差异有统计学意意义;

方差分析：小鼠体重， 组间比较， 染毒前：各组间比较， F=0.119， p=0.948， 差异无统计学意意义。染毒后， F=6.040，p=0.002， 与组间比较， 与正常组比较，▲▲P<0.01， 差异有统计学意意义; 中药干预后：各组间比较， F=2.350， p=0.089， 与正常组比较， ▲P<0.05， 差异有统计学意意义;

组内前中后比较， 绿豆组，染毒前， 染毒后， 中药干预后（前中后）比较， F=3.677， p=0.035，与染毒后比较， aP<0.05， 中药干预后明显升高，差异有统计学意意义; 清千组（前中后）比较， F=9.757， p=0.001， 与染毒后比较， b P<0.01， 染毒后明显下降，中药干预后明显升高，差异有统计学意意义; 模型组（前中后）比较， F=0.428 p=0.656，差异无统计学意意义; 正常组（前中后）比较， F=0.700 p=0.505，差异无统计学意意义;

3讨论

3.1本次实验染毒 10 天，绿豆组死亡2只， 模型组死亡2只， 清千组和正常对照组无死亡。

3.2造模后血红蛋白下降，说明造血系统受到损害。汞对造血系统的抑制作用，主要对血红素合成过程中关键酶的抑制，造成血红素减少引起贫血[6]。

3.3脑乙酰胆碱酯酶（AchE），乙酰胆碱转移酶（chAT），是大脑中与记忆有关的关键酶，为科学界普遍公认，它们存在于大脑神经细胞中，主要分布在海马部位和皮层，乙酰胆碱转移酶催化合成神经递质乙酰胆碱，而乙酰胆碱酯酶则催化乙酰胆碱分解，它们的活性维持着乙酰胆碱合成与分解的平衡，从而维持着神经传导正常进行和记忆。本实验表明，染毒小鼠乙酰胆碱转移酶活性明显下降，催化乙酰胆碱合成减少，而乙酰胆碱酯酶活性没有降低，催化乙酰胆碱分解没有降低，势必造成神经递质乙酰胆碱减少而影响记忆功能[7]。

3.4其他，脑（GSH-PX）活力和脑超氧阴离子自由基（）清除率%、。（GSH-PX）活力是机体清除超氧阴离子自由基（）重要的酶[4]，汞中毒小鼠模型组（GSH-PX）活力明显降低，低于正常组，表明清除超氧阴离子自由基（）能力下降，而另一实验指标，超氧阴离子自由基（）清除率%汞中毒组降低则证明了这点。而中药干预组在模型组与正常组之间，表明清除超氧阴离子自由基（）能力已明显提升，绿豆组己接近正常组正常组。

3.5其他，从血清尿素氮含量表明，模型组最高，其次是绿豆组，最低是清千组，说明模型组肾脏排泄功能受到一定损害，而清千组保护肾脏排泄功能最好，血清尿素氮含量还低于正常组。体重变化表明，染毒三个组染毒后有降低，正常组没有变化，中药干预后有回升，由于后阶段己停止染毒，所以模型组体重也缓慢升高，但较慢。正常组体重一直在升高，但由于时间仅30天，没有太大变化。血清总胆固醇（TC）各组间差异无显著性，而甘油三酯（TG）正常组明显高于染毒三个组，血清蛋白染毒组还高正常组，表明汞染毒损害了肝脏对甘油三酯代谢，而对肝脏胆固醇代谢、蛋白代谢尚未损害到，一般认为，肝脏代偿能力较大，损害较严重时才引起蛋白异常。有关这方面的解释，还需进一步探讨。

参考文献：

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[7] 何胜， 杨彩梅 ，吕庚珉，海尔福对汞中毒小鼠模型治疗效果的研究. [J].中国冶金工业医学杂志，2008.

第一作者：黄精贵，女，出生年月：1998年02月。右江民族医学院2017级药学本科班学生。通讯作者：李文仕，副主任药师，E-mail： sqzhang224@163.com