铜绿假单胞菌碳青霉烯类抗生素耐药机制研究

摘要：目的 探究杭州某医院铜绿假单胞菌的耐药机制。方法 采用纸片扩散法对耐药菌株进行筛选;抗生素的最低抑菌浓度（MIC）用琼脂稀释法检测;PCR扩增碳青霉烯酶基因（blaKPC-2、blaMCR-1、blaIMP-1、blaIMP-2、blaVIM-1、blaVIM-2）;用MLST对铜绿假单胞菌进行ST分型。结果 78株对亚胺培南耐药的铜绿假单胞菌中发现24株含KPC-2型碳青霉烯酶，MLST结果显示，21株（87.5%）为ST463，2株（8.3%）为ST1076，1株（4.2%）为ST244。结论 KPC-2酶已成为杭州某医院铜绿假单胞菌碳青霉烯类抗生素耐药重要原因之一，ST463是该院产KPC-2酶铜绿假单胞菌主要ST型别。

关键词：碳青霉烯酶;铜绿假单胞菌;KPC-2

【中图分类号】R453.2 【文献标识码】A 【文章编號】1673-9026（2021）08-019-02

上世纪70年代后期研发出的碳青霉烯类抗生素是该时期抗菌谱最广、抗菌活性最强的非典型β-内酰胺类抗生素，被认为是抗生素的最后一道防线[1]。碳青霉烯类抗生素主要通过抑制青霉素结合蛋白从而抑制参与细菌细胞壁黏肽合成的内肽酶和糖苷酶的合成，使细菌的细胞壁破损，致细菌膨胀、溶解、失活，从而达到灭菌效果。近年来，由于临床广谱抗生素的大量使用，铜绿假单胞菌（PAE）对各类抗生素的耐药性均逐年升高，对医院的院内感染防控和临床的抗感染治疗造成巨大的挑战。

目前，人们发现CRPA的耐药机制主要有：（1）主动外排系统过表达;（2）产生碳青霉烯水解酶;（3）外膜蛋白OprD2的缺失或突变等。除上述耐药机制外，铜绿假单胞菌新的耐药机制还在不断地产生。如2013年，中国在世界上首次报道从泛耐药铜绿假单胞菌中查出KPC型β-内酰胺酶基因[2]。肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶（KPC）主要存在于肠杆菌科细菌内，是近些年来人们重点关注的碳青霉烯酶之一，其不仅可以水解所有β-内酰胺类抗生素，包括碳青霉烯类抗生素，而且阿莫西林/克拉维酸（AMC）也不能完全将其灭活[3]。

在PAE对碳青霉烯类抗生素耐药机制的研究中，关于KPC等非金属酶的报道相对于金属酶型碳青霉烯酶，目前依然较少，但种种报道表明这些非金属酶导致的耐药机制在逐渐由肠杆菌往非发酵菌扩散 [2、4]。此次研究对从该医院住院患者标本中分离出的78株CRPA进行研究，发现KPC-2已经成为该院铜绿假单胞菌流行较广的碳青霉烯酶之一，现将结果报道如下。

1 材料和方法

1.1 菌株来源 从2018年7月至2019年7月杭州某医院两院区住院患者的各类标本中分离出78株对碳青霉烯类抗生素耐药的铜绿假单胞菌，采用全自动微生物鉴定仪（Vitek 2 Compact）鉴定细菌到种。K-B纸片法验证菌株对碳青霉烯类抗生素的敏感性。

1.2 主要仪器和试剂 主要仪器设备：全自动微生物鉴定仪Vitek-2 Compact、比浊仪Vitek Densichek（法国BioMérieux公司）;PCR扩增仪（德国Biometra公司）;VITEK MS质谱鉴定系统（法国生物梅里埃公司）;Powerpac基础电泳仪（美国BIO-RAD公司）。主要试剂：M-H琼脂干粉、哥伦比亚基础琼脂干粉（英国Oxoid公司）;中国蓝玫瑰酸琼脂（杭州天和微生物试剂有限公司）;VITEK GP和GN鉴定卡（法国BioMérieux公司）;核酸电泳琼脂糖（西班牙Biowest公司）;VITEK MS配套试剂：α-氰4-羟基苯丙烯酸（HCCA）、三氟乙酸（TFA）、无水乙醇、甲酸、色谱纯乙腈（美国Sigma公司）;PCR反应试剂盒、DNA Marker DL20，00、DL5，000、DL15，000（日本Takara公司）。

1.3 细菌的鉴定 用Vitek 2 Compact全自动微生物鉴定仪和VITEK MS质谱鉴定系统对住院患者中分离的CRPA进行重新鉴定。（参照相应仪器的说明进行Vitek 2 Compact全自动微生物鉴定仪和VITEK MS的操作）

1.4 PCR扩增耐药基因和序列分析 PCR扩增碳青霉烯酶基因（blaKPC-2、blaMCR-1、blaIMP-1、blaIMP-2、blaVIM-1、blaVIM-2）。耐药基因引物相关信息见表1。用碱裂解法提取细菌质粒DNA作为模板。PCR反应体系：5μl 10×Buffer 缓冲液，3μl dNTP，0.25μl Taq DNA聚合酶，3μl DNA模板，上下游引物各1μl，用无菌纯水补足到50μl。PCR反应条件：94℃预变性5min，1个循环;94℃变性1min，退火1min（退火温度根据不同引物而定），72℃延伸1min，35个循环;72℃延伸7min，1个循环。用1%琼脂糖凝胶对耐药基因进行恒压电泳，电压：100V，时间：25min，最后在紫外灯下观察结果。

1.5 多位点序列分型（multilocus sequence typing，MLST） PCR扩增铜绿假单胞菌7对管家基因（acsA、aroE、guaA、mutL、nuoD、ppsA、trpE）。引物序列、TM、扩增长度见表2。具体操作方法：提取细菌基因组DNA作为模板，PCR反应体系：5μl 10×Buffer 缓冲液，3μl dNTP，0.25μl Taq DNA聚合酶，3μl DNA模板，上下游引物各1μl，用无菌纯水补足到50μl。PCR反应条件同上，紫外灯下观察结果。将获得的PCR产物纯化后送上海生工公司测序，将序列结果提交到数据库https：//pubmlst.org/paeruginosa/info/primers.shtml进行在线序列比对，最终确定菌株的MLST型别。

2 结果

2.1 菌株收集情况 2018年7月至2019年7月，从该医院两院区住院患者标本中分离得到碳青霉烯类抗生素耐药铜绿假单胞菌78株，其中69株分离自老院区，9株分离自新院区。其中65.4%（51/78）的菌株分离自ICU病房。痰液是此次研究中耐药菌株的主要来源，60.3%（47/78）菌株来自痰液，19.2%（15/78）菌株来自尿液，20.5%（16/78）菌株来自其他标本（粪便、脓液、胆汁、全血等）。

2.2 菌株耐药基因检测情况 通过耐药基因检测，78株碳青霉烯类抗生素耐药的铜绿假单胞菌中有24株为KPC-2阳性（表3）。

2.3 药物敏感性试验 采用琼脂稀释法检测24株KPC-2阳性铜绿假单胞菌对临床上常用的头孢类、碳青霉烯类、氨基糖苷类、氟喹诺酮类等抗生素的药物敏感性，根据铜绿假单胞菌药敏试验解释标准判断菌株的药物敏感性。检测结果为：24株菌株全部都对碳青霉烯类药物耐药，多数菌株（≥75%）对头孢类抗生素（头孢曲松，头孢吡肟）、氨曲南、替加环素耐药;少数菌株（≤25%）对氨基糖苷类（庆大霉素，阿米卡星，妥布霉素）耐药;另有70.8%（17/24）菌株对左旋氧氟沙星耐药，62.5%（15/24）对环丙沙星耐药。

2.4 多位点序列分析 利用已知的7对管家基因对24株CRPA进行多位点序列分型，分型结果见表4。ST463为主要分型，高达87.5%，只有个别菌株为ST1076和ST244型。

3.分析和讨论

铜绿假单胞菌是医院感染的主要病菌之一，免疫力低下的患者常常容易被感染。并且多重耐药菌株的阳性率也呈逐年上升的趋势，在该医院也形成了广泛的流行，甚至出现了泛耐药菌株，其对碳青霉烯类、氨基糖苷类、头孢类和氟喹诺酮类等临床常用抗生素均耐药，这给医院的临床治疗带来极大挑战[5]。

近些年来，對碳青霉烯类抗菌药物耐药的PAE在全球范围内大流行，国外对耐药菌株的报道也日益增多[6]。研究发现铜绿假单胞菌中碳青霉烯酶类型大不相同，据国外报道显示，其铜绿假单胞菌所产的碳青霉烯酶主要以VIM为主，且有多种亚型，另外IMP型也较多见[7、8]。而本次对该医院的78株铜绿假单胞菌耐药基因的检测显示30.8%（24/78）的菌株为KPC-2型，未见VIM和IMP型耐药菌株。

在世界范围内，铜绿假单胞菌的多位点序列分型（MLST）较多的是ST235，ST244，ST357等[9]。德国有过报道产KPC-2的铜绿假单胞菌为ST235[10]，且ST235曾在世纪范围大流行，西班牙、韩国等地都有过爆发[11-12]。另外2018年在巴西发现了新的产KPC-2铜绿假单胞菌分型：ST2584[13]。而本次实验的24株KPC-2阳性铜绿假单胞菌菌株的多位点序列分型结果显示ST463型菌株高达87.5%，为主要分型，不同于其他国家，提示国内流行有其特异性。

2007年杭州的浙一医院首次报道了我国产KPC-2酶肺炎克雷伯菌[14]，随后在2011国内出现首例产KPC-2酶铜绿假单胞菌[15]。2015年有研究证实肺炎克雷伯菌和铜绿假单胞菌携带的KPC-2型碳青霉烯酶的编码基因位于质粒上，并确定碳青霉烯类抗生素的耐药性能够伴同质粒在不同菌种间传播[16]。结合本次实验数据，高达87.5%的ST463型菌株携带者多为ICU病房住院患者，提示克隆传播的可能性极大，这对住院患者的临床治疗带来巨大的挑战，且必须对产KPC-2铜绿假单胞菌株加以预防和控制，防止其进一步流行播散。

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作者简介：何胜兵（1997-04）男，汉族，安徽省滁州市，杭州市儿童医院，技师，本科，理学学士学位，细菌耐药性