组蛋白去乙酰化酶抑制剂与PD98059缀合物对皮肤鳞状细胞癌的疗效研究

张良，陈娜，付昱，郑亮，肖婧，陈柳青

皮肤鳞状细胞癌（squamous cell carcinoma，SCC）是源于皮肤组织中角质形成细胞的恶性肿瘤，是全世界范围内常见的皮肤癌［1］。目前对于不能手术治疗的SCC 患者常采用顺铂、5-氟尿嘧啶等化疗药进行治疗，但这些药物会引起糖代谢紊乱等严重不良反应［2］。因此，开发有效、安全的靶向药物是当前SCC诊疗领域的热点和难点。最近一项关于复发或转移性头颈鳞状细胞癌治疗的Ⅱ期临床试验研究表明，组蛋白去乙酰化酶（histone deacetylase，HDAC）抑制剂丙戊酸联合顺铂和西妥昔单抗对其有良好的治疗效果［3］。但是，不同药物之间存在药代动力学差异，使得这种“鸡尾酒”疗法中的药物难以共同发挥各自的最佳疗效［4］。因此，将多个药物拼接成一个单一的药物分子来治疗肿瘤已是当前药物研发领域的重点方向［5］。2-（2-氨基-3-甲氧苯基）色酮（PD98059）是丝裂原活化蛋白激酶/细胞外信号调节激酶（MAPK/ERK）信号转导通路的阻断剂，可抑制包括SCC在内的多种肿瘤的生长［6］。目前有关PD98059联合其他药物治疗SCC的研究尚少见。本研究将HDAC抑制剂伏立诺他（SAHA）与PD98059偶联构建单一结构的缀合物（SAHA-PD9805），并在细胞和动物模型上评价其抗SCC活性。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 SPF 级 BALB/c 裸鼠 56 只，4～5 周龄，雌雄各半，体质量18～24 g，平均（21.0±3.4）g，购自成都达硕实验动物有限公司，动物许可证号SCXK（川）2015-030。实验过程中动物自由摄水、食物，自由光照，温度25 ℃，相对湿度50%；本研究经武汉市第一医院动物伦理委员会批准。

1.1.2 实验细胞 人皮肤鳞癌细胞A431、HSC-5、Colo16、SCC-12 和人正常皮肤细胞TE353.sk 购自中科院上海细胞所，由本实验室冻存使用。

1.1.3 实验试剂 PD98059（WXCD00602105）、8-氯-8-氧代辛酸甲酯（385565-1G）、盐酸羟胺（A46614）购自北京伊诺凯科技有限公司；HDAC试剂盒（K330-100）购自艾美捷科技有限公司。

1.1.4 实验仪器 XT4 型显微熔点测定仪（温度未校正）购自北京市科仪电光仪器厂；BrukerAM-400 Hz 型磁共振仪（CDCl3或DMSO-d6为溶剂，四甲基硅烷为内标）购自瑞士Bruker公司；ELx800型酶标仪购自美国Biotek公司。

1.2 方法

1.2.1 中间体1 的制备 氩气保护下，将PD98059（1.336 g，5 mmol）、8-氯-8-氧代辛酸甲酯（2.067 g，10 mmol）溶解加入到乙腈（60 mL）中，冰浴下滴加三乙胺（2.8 mL，20 mmol），室温反应12 h 后，减压脱去溶剂，粗产物用硅胶柱纯化（石油醚∶乙酸乙酯=2∶1，V/V），得1.273 g浅黄色固体，产率58.2%；1H-NMR（400 MHz，CDCl3）δ：8.05（d，J=8.0 Hz，1H），7.83～7.87（m，1H），7.76（t，J=7.6 Hz，1H），7.67～7.70（m，1H），7.07（d，J=8.0 Hz，1H），6.96（d，J=8.0 Hz，1H），6.71（t，J=8.0 Hz，1H），6.55（s，1H），3.84（s，3H），3.62（s，3H），2.20～2.27（m，4H），1.58～1.68（m，4H），1.27～1.32（m，4H）。

1.2.2 目标缀合物SAHA-PD98059的制备 氩气保护下，将中间体1（1.224 g，2.8 mmol）溶解加入无水四氢呋喃（10 mL）中，冰浴下加入氢氧化钾（0.236 g，4.2 mmol）和新配置的羟胺溶液，室温反应1 h后，减压脱去溶剂，向残留物中加入10 mL蒸馏水，用2 mol/L的盐酸调节pH=7，加入乙酸乙酯进行萃取（萃取3 次，每次加入25 mL），有机层用无水Na2SO4干燥，减压脱去溶剂，粗产物用硅胶柱纯化（二氯甲烷∶甲醇=12∶1，V/V），得591 mg浅黄色固体，产率48.1%。新羟胺溶液的制备如下：将盐酸羟胺（2.919 g，42 mmol）、氢氧化钾（2.353 g，42 mmol）溶解到25 mL 甲醇中，反应液加热至40 ℃反应15 min后，析出大量的沉淀，经过滤得到的滤液即为新鲜的羟胺溶液。

1.2.3 HDAC活性抑制测试 使用HDAC荧光检测试剂盒测试缀合物SAHA-PD98059 对HDAC 活性的抑制作用，以SAHA为阳性对照药。按照试剂盒操作说明书，在96孔测试板中加入血清白蛋白（BSA）、HDAC 荧光底物、HDAC 酶（HeLa 细胞核提取物）和不同浓度梯度（1×104、1×103、1×102、10、1、0.1、1×10-2nmol/L）的缀合物SAHA-PD98059。将测试板在37 ℃下反应30 min 后，每孔再加入HDAC 缓冲液，于37 ℃下继续放置15 min，使用酶标仪在359 nm 和440 nm 波长测定每孔的荧光强度，计算半抑制浓度（IC50）。

1.2.4 分子模拟 从Protein Data Bank（PDB）数据库中下载HDAC（PDB code：1ZZ1）［7］的结构。通过 ChemBio 3D ultra 14.0 和Autodock 4.2D 中的Ligand 模块进行小分子结构的预处理。对接软件使用Autodock 4.2D，利用晶体结构中的配体定义口袋盒子，对接盒子边长设置为30 Å，使用半经验自由能进行评价，拉马克遗传算法循环100 次，其余参数保持默认，进行分子对接。对接结果使用PyMOL1.8.6进行绘图。

1.2.5 细胞培养 A431、HSC-5、Colo16、SCC-12和TE353.sk细胞用含有10%胎牛血清（FBS）的DMEM培养基培养，5%CO2、37 ℃培养箱，湿度为95%。细胞生长至对数期进行后续实验。

1.2.6 体外抗增殖作用实验 取对数生长期细胞接种于96孔板中，细胞密度约为8×103个/孔，在5%CO2、37 ℃培养箱中孵育24 h，弃去培养基，每孔加入200 μL 不同浓度的待测缀合物SAHA-PD98059，并以SAHA和PD98059为阳性对照，而空白组加入等体积的培养基，继续孵育3 d，每孔再加入25 μL 5-［3-（羧基甲氧基）苯基］-3-（4，5-二甲基-2-噻唑基）-2-（4-磺基苯基）-2H-四唑内盐（MTS）溶液，继续孵育4 h，在波长为490 nm处用酶标仪测定每孔光密度（OD）值，计算抑制率（I）=［1-（OD1-OD0）（/OD2-OD0）］×100%。其中OD0为空白孔OD值，OD1为加药组细胞OD值，OD2为不加药的对照组细胞OD值。

1.2.7 急性毒性实验 为探讨缀合物SAHA-PD98059 在动物体内的毒性，按照文献［8］的方法，选取4～5周龄的裸鼠40只，采用随机数字表法分为5个不同的给药剂量组，给药剂量分别为346.4、457.1、603.9、798.0、1 054.4 mg/kg，每组8只，雌雄各半，于灌胃给药后1 h、5 h、第4天、第5～18天观察实验小鼠的存活状态，并通过寇氏法［8］计算出缀合物SAHAPD98059的半数致死量（LD50）及LD50的95%可信区间。

1.2.8 体内抗增殖作用实验 根据体外抗肿瘤活性实验结果，选择A431 细胞构建动物模型，以进一步评价缀合物SAHA-PD98059的体内抗人皮肤鳞癌能力。将A431细胞接种到4～5周龄的BALB/c 裸鼠左侧肩部皮下（每只100 μL，5×106细胞），待肿瘤体积大小为80 mm3后，采用随机数字表法将小鼠分为SAHA-PD98059组、SAHA组、PD98059组和空白对照组，每组4 只，雌雄各半，将缀合物SAHA-PD98059、SAHA和PD98059用聚乙烯蓖麻油∶DMSO∶PBS（1∶1∶8）溶解后进行灌胃给药。SAHA-PD98059 组、SAHA 组和PD98059组的给药剂量均为25 mg（/kg·d），其中空白对照组给予等体积的溶剂（聚乙烯蓖麻油∶DMSO∶PBS=1∶1∶8），连续给药18 d。每隔2 d 称量实验小鼠的体质量，计算小鼠体质量变化率=Mn/M0×100%，其中M0为给药治疗前小鼠的体质量（g），Mn为给药第n天小鼠的体质量（g）。测量肿瘤长、宽，计算肿瘤体积（V，mm3）=a×b2/2，其中a为肿瘤的最长径（mm），b为肿瘤的最短径（mm）。在治疗18 d后，取出肿瘤并称量质量。

1.2.9 HE染色观察小鼠主要器官的病理学变化 空白对照组和SAHA-PD98059 组小鼠在给药治疗结束后通过颈椎脱臼法将其处死，取下心、脑、肝、脾、肾，用4%多聚甲醛进行固定，然后用石蜡包埋，切片厚度为5 μm。按照HE 试剂盒说明书的操作步骤进行染色，于倒置显微镜下对组织形态进行观察，扫描拍照。

1.3 统计学方法 采用SPSS 21.0软件进行数据分析。计量资料以均数±标准差（）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间多重比较行LSD-t检验，不同时点组间比较采用重复测量设计的方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 缀合物SAHA-PD98059 的制备与表征 缀合物SAHA-PD98059 按照图1 路线进行合成。首先，通过亲核取代反应制得中间体1，然后用羟胺将中间体1的甲酯转化成肟酸制得了目标缀合物SAHAPD98059，其结构通过氢质子磁共振波谱进行了确证：1H-NMR（400 MHz，DMSO-d6）δ：10.41（s，1H），9.41（s，1H），8.70（s，1H），8.06（d，J=8.4 Hz，1H），7.80～7.84（m，1H），7.78（t，J=8.0 Hz，1H），7.48（d，J=8.0 Hz，1H），7.08（d，J=8.0 Hz，1H），7.02（d，J=7.6 Hz，1H），6.68（t，J=8.4 Hz，1H），6.54（s，1H），3.87（s，3H），2.22（t，J=6.8 Hz，2H），1.96（t，J=6.4 Hz，2H），1.48～1.54（m，4H），1.26～1.31（m，4H）。

Fig.1 Synthetic route of conjugate SAHA-PD98059图1 SAHA-PD98059缀合物的合成路线

2.2 缀合物SAHA-PD98059 对HDAC 的抑制活性 缀合物SAHA-PD98059抑制HDAC的量效曲线见图2，其IC50为（142.9±1.2）nmol/L。

Fig.2 Dose-response curves of conjugate SAHA-PD98059 against HDAC图2 缀合物SAHA-PD98059抑制HDAC的量效曲线

2.3 缀合物SAHA-PD98059 与HDAC 相互作用的分子对接 缀合物SAHA-PD98059与SAHA均采用了最佳的结合结构与HDAC 的活性口袋相结合。SAHA 在HDAC 活性口袋中能够与氨基酸残基H142、H143和T312形成氢键，同时其肟酸基团也均与锌离子进行了螯合。缀合物SAHA-PD98059 在HDAC 活性口袋中也与氨基酸残基H142 和T312 形成氢键作用，因此缀合物SAHA-PD98059 对HDAC有较强的抑制活性。进一步分析对接结果发现，尽管缀合物SAHA-PD98059 未与H143 形成氢键作用（图3A），但是与另外一个氨基酸残基G151 形成了氢键（图3B）。

Fig.3 Docked complexes of SAHA and SAHA-PD98059 bound to HDAC图3 SAHA和缀合物SAHA-PD98059与HDAC分子对接结果

2.4 缀合物SAHA-PD98059 的体外抗增殖作用结果 与母体化合物PD98059 及SAHA 相比，缀合物 SAHA-PD98059 对皮肤鳞癌细胞 A431、HSC-5、Colo16和SCC-12的抗增殖作用均更强，其中缀合物SAHA-PD98059 对A431 细胞的抗增殖作用最强。此外，缀合物SAHA-PD98059 抑制人正常皮肤细胞TE353.sk 的 IC50＞100 μmol/L，表明其基本无毒性。见表1。

Tab.1 Anti-proliferative activity of conjugate PD98059-SAHA表1 缀合物PD98059-SAHA的抗增殖作用（n=3，）

Tab.1 Anti-proliferative activity of conjugate PD98059-SAHA表1 缀合物PD98059-SAHA的抗增殖作用（n=3，）

＊P＜0.05；a与PD98059组比较，b与SAHA组比较，P＜0.05

组别PD98059组SAHA组PD98059-SAHA组F IC50（μmol/L）A431 11.1±2.0 9.6±1.5 1.7±0.2ab 37.141＊HSC-5 15.7±1.4 10.3±1.2a 6.8±0.7ab 47.823＊Colo16 14.8±1.2 8.1±0.9a 5.3±0.5ab 92.580＊SCC-12 17.5±1.6 11.7±1.2a 9.3±1.2ab 29.799＊TE353.sk＞100＞100＞100-

2.5 缀合物SAHA-PD98059 的急性毒性结果 当给予实验小鼠346.4 mg/kg 剂量时，在18 d 内全部存活；而当给予大剂量1 054.4 mg/kg时，实验小鼠全部死亡，见表2。根据不同剂量组的小鼠死亡情况，计算缀合物 PD98059-SAHA 的 LD50为 647.5 mg/kg，其95%的可信区间为435.1～970.4 mg/kg。

Tab.2 Acute toxicity of conjugate PD98059-SAHA in mice表2 缀合物PD98059-SAHA的急性毒性实验结果（例）

2.6 体内抗肿瘤活性

2.6.1 体质量变化率 组内比较：PD98059 组给药6～15 d时体质量变化率高于给药0、3 d，给药18 d时体质量变化率高于0～12 d（P＜0.05）；SAHA 组给药9～15 d时体质量变化率高于给药0、3 d，给药18 d时体 质量 变 化 率 高于 0～12 d（P＜0.05）；SAHAPD98059组给药后不同时点体质量变化率差异无统计学意义（P＞0.05）。组间比较：给药 18 d 时，SAHA-PD98059 组体质量变化率均低于空白对照组、PD98059组和SAHA组（P＜0.05），其余时点各组间体质量变化率差异均无统计学意义，见表3。

Tab.3 Average weight changes in mice after drug treatment表3 给药后不同时点各组小鼠体质量变化率的比较 （n=4，%，）

Tab.3 Average weight changes in mice after drug treatment表3 给药后不同时点各组小鼠体质量变化率的比较 （n=4，%，）

＊P＜0.05；F组间=4.676，P＞0.05；F时间=15.830，P＜0.05；F交互=0.583，P＞0.05；组间比较：a与空白对照组比较，b与PD98059组比较，c与SAHA组比较，P＜0.05；组内比较：A与0 d比较，B与3 d比较，C与6 d比较，D与9 d比较，E与12 d比较，P＜0.05

组别空白对照组PD98059组SAHA组SAHA-PD98059组F 0 d 100.0±3.1 100.0±1.3 100.0±2.9 100.0±3.0 0.480 3 d 101.6±3.1 101.9±1.2 101.9±2.7 102.0±2.2 0.769 6 d 103.0±3.3 103.6±2.1AB 104.6±2.6 104.4±1.8 0.809 9 d 104.3±3.5 104.8±1.6AB 105.6±1.2AB 103.6±2.3 0.898 12 d 104.8±4.0 105.0±1.2AB 105.9±1.1AB 104.1±2.4 0.711 15 d 106.7±3.6A 106.2±1.1AB 107.5±2.1AB 103.6±2.8 0.959 18 d 108.4±3.4AB 108.1±1.2ABCDE 108.9±2.2ABCDE 104.2±2.6abc 3.724＊F 2.702＊14.038＊7.602＊1.728

2.6.2 肿瘤体积 各组小鼠肿瘤体积均随给药时间呈基本增大趋势（P＜0.05）。给药0、3 d 时，各组肿瘤体积差异无统计学意义（P＞0.05）；给药6～18 d时，PD98059 组、SAHA 组和 PD98059-SAHA 组肿瘤体积均低于空白对照组，PD98059-SAHA 组肿瘤体积低于PD98059组和SAHA组（P＜0.05），见表4。

Tab.4 Average tumor volume changes in mice after drug treatment表4 给药后各组小鼠肿瘤体积的变化 （n=4，mm3，）

Tab.4 Average tumor volume changes in mice after drug treatment表4 给药后各组小鼠肿瘤体积的变化 （n=4，mm3，）

＊P＜0.05；F组间=98.577，F时间=178.818，F交互=12.476，均P＜0.01；组间比较：a与空白对照组比较，b与PD98059组比较，c与SAHA组比较，P＜0.05；组内比较：A与0 d比较，B与3 d比较，C与6 d比较，D与9 d比较，E与12 d比较，F与15 d比较，P＜0.05

组别空白对照组PD98059组SAHA组PD98059-SAHA组F给药时间0 d 85.7±4.1 86.2±7.1 86.3±8.9 85.4±7.5 0.010 3 d 160.1±15.8A 155.6±26.9A 152.8±22.8A 137.6±7.9A 0.729 6 d 288.5±38.4AB 205.8±20.4ABa 198.9±19.9ABa 157.9±11.3ABabc 14.923＊9 d 390.6±45.3ABC 294.6±47.3ABCa 282.8±45.9ABCa 180.0±20.4ABabc 13.071＊12 d 608.9±113.5ABCD 382.8±67.6ABCa 367.4±63.9ABCa 200.9±24.9ABCabc 15.220＊15 d 823.9±108.9ABCD 539.4±80.4ABCDEa 515.8±69.5ABCDEa 243.1±33.4ABCDabc 27.828＊18 d 1 000.5±138.7ABCDE 711.3±55.1ABCDEFa 686.9±52.4ABCDEFa 309.1±49.8ABCDEabc 35.077＊F 51.876＊59.623＊64.865＊22.871＊

2.6.3 肿瘤质量 治疗18 d 后，空白对照组、SAHA组、PD98059 组和SAHA-PD98059 组小鼠肿瘤质量（mg）分别为 1 259.5±60.9、693.5±12.4、657.1±5.9 和253.8±18.8（n=4，F=78.317，P＜0.05）。其中 SAHA组和PD98059 组低于空白对照组，SAHA-PD98059组较其他3组均低（均P＜0.05），见图4。

Fig.4 Tumors in mice after 18 days of drug treatment图4 治疗18 d后小鼠的肿瘤

2.7 HE染色观察小鼠主要器官的病理学改变 与空白对照组相比，SAHA-PD98059 组心、脑、肝、脾、肾均无明显病理变化；心脏的心肌细胞结构完整；脑神经细胞结构完整；肝脏的肝细胞结构完整；脾的淋巴细胞结构完整；肾脏中肾单位细胞结构完整，见图5。

Fig.5 The pathological changes of main organs of A431 tumor-bearing mice observed by HE staining(×400)图5 HE染色观察A431荷瘤鼠主要器官病理改变（×400）

3 讨论

HDAC 是参与表观遗传调控的蛋白酶家族，在染色体的结构修饰和基因表达调控中发挥重要作用［9-10］。大量研究表明，在 SCC［11］、乳腺癌［12］、肝癌［13］等多种肿瘤组织中均存在HDAC异常高表达的现象，HDAC是肿瘤治疗的一个有效靶点。HDAC抑制剂通过阻断HDAC 的功能，影响基因表达和细胞周期，促进肿瘤细胞分化，诱导肿瘤细胞凋亡；此外，HDAC 抑制剂还能抑制肿瘤血管生成，导致肿瘤营养物质供应不足，从而抑制肿瘤增殖［14］。目前已有多个HDAC 抑制剂被批准用于癌症治疗，例如FK228被美国食品药品监督管理局（FDA）批准用于治疗外周T 细胞淋巴瘤；西本达胺被中国食品药品监督管理局（CFDA）批准用于治疗复发及难治性外周T 细胞淋巴瘤等［7，15-16］。有研究报道，将HDAC 抑制剂与雌激素受体［17］、Janus 激酶［18］、血管内皮细胞生长因子受体［19］等靶向药物偶联制成多靶点抑制剂较单靶点药物具有更好的抗肿瘤效果。Thakur等［20］将HDAC 与磷脂酰肌醇3-激酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3K）抑制剂偶联成单一分子后对急性髓细胞性白血病具有良好的疗效，且对正常细胞无明显毒性。

有研究表明，HDAC 抑制剂在与HDAC 蛋白相互作用时，HDAC抑制剂结构中的表面识别区（Cap）基团仅占据了HDAC 活性口袋的一小部分，若使用一些空间位阻较大基团取代HDAC抑制剂的Cap，可增强其与HDAC 蛋白的相互作用，明显提高其对HDAC 活性的抑制作用［21］。本研究通过将PD98059引入到HDAC 抑制剂SAHA 上，拟得到对HDAC 和SCC 抑制活性较SAHA 与PD98059 更强的缀合物SAHA-PD98059。有研究显示，先导化合物SAHA抑制HDAC的IC50为196.0 nmo/L［22］，而本研究结果显示缀合物SAHA-PD98059 的IC50为（142.9±1.2）nmo/L。通过分子对接研究发现，SAHA-PD98059 抑制HDAC 的IC50较低的可能原因是其在HDAC 酶活性口袋中形成了一个新氢键。这个新氢键是与氨基酸残基G151形成了氢键，而该氢键作用对配体的抑制活性至关重要［23］。此外，与SAHA的苯环相比，缀合物SAHA-PD98059 具有更大的帽子结构（PD98059基团），增强了其与HDAC 活性口袋的相互作用，从而提高了其对HDAC活性的抑制作用［24］。体外实验结果显示，与母体化合物PD98059及SAHA相比，缀合物SAHA-PD98059对皮肤鳞癌细胞A431、HSC-5、Colo16和SCC-12的抗增殖作用均更强，其中缀合物SAHA-PD98059 对A431 细胞的抗增殖作用最强。此外，缀合物SAHA-PD98059 抑制人正常皮肤细胞TE353.sk 的 IC50＞100 μmol/L，表明其基本无毒性。进一步体内急性毒性及抗肿瘤作用实验结果显示，缀合物SAHA-PD98059 对小鼠的LD50高达647.5 mg/kg；在A431荷瘤鼠中，与母体化合物PD98059和SAHA 相比，缀合物SAHA-PD98059 可显著抑制肿瘤体积以及质量的增长。HE染色亦显示，缀合物SAHA-PD98059对心、脑、肝、脾、肾等主要器官均无明显毒性。综上，缀合物SAHA-PD98059 用于治疗SCC 安全有效，且其效果强于单一使用SAHA 或PD98059。