应用宏基因组二代测序技术诊断结核病4例并文献复习

张奕杰

(首都医科大学附属北京天坛医院呼吸与危重症医学科， 北京 100070)

结核病是由MTB复合群感染引起的慢性传染病，不仅是世界十大致死原因之一，也是最致命的传染病，随着多耐药、广泛耐药及全耐药结核的日益增多，使得结核病的治疗难度不断增加，因此对于MTB的及时诊断、传播致病及耐药机制研究就显得尤为重要[1]。应用二代测序能够鉴定结核与非结核分枝杆菌(NTM)以及检测耐药基因，可从基因组水平进行深入研究耐药、毒力、致病机制。宏基因组学(metagenomics)是指直接从人类组织活检和体液样本中检测出微生物组总DNA或RNA，分析全部微生物组成，基于二代测序的宏基因组学，简称mNGS。随着测序流程优化，成本降低，目前周期可缩短至24h以内，可实现临床快速诊断及精准治疗，使得患者获益，因此本文结合国内外文献以及我院4例应用mNGS技术诊断结核菌感染病例，对其应用价值进行讨论。

1 资料与方法

1.1一般资料:选取由首都医科大学附属北京天坛医院呼吸与危重症科收治的4例应用mNGS技术作为重要临床诊断依据确诊为结核感染的患者作为病例资料，确诊结核感染标准：上述送检标本MTB培养阳性、涂片阳性、病理诊断为结核感染、mNGS检测阳性等4项中至少1项符合即可确诊。当至少1条read比对到种或复合群水平时，结果被认为是MTB阳性。

1.2方法:以“二代测序”或“NGS”和“结核”作为关键词，在万方数据库和中国知网数据库对2021年1月以前的中文文献进行检索，在PubMed数据库以“NGS，tuberculosis”为关键词检索2021年12月以前的英文文献，共154篇，排除会议、报纸、综述，以文章提供了mNGS、传统方法、Xpert结果为纳入标准，最后共有453例确诊或临床诊断为MTB感染的临床资料纳入本研究。

2 结 果

2.1病例1:患者女性，47岁，2014年体检时行胸部CT检查发现右侧胸腔积液，伴咳嗽、咳黄白痰及活动后气短，未诊治。2020年8月行胸腔超声提示右侧胸腔积液伴包裹入院。患病以来无不适。查体：右肺呼吸音低，叩诊浊音。辅助检查：血常规提示白细胞计数12.37×109L-1，中性粒细胞绝对值10.62×109L-1，中性粒细胞相对值85.7%；2020年9月21日胸部CT：右侧包裹性胸腔积液；右肺下叶局部肺组织含气不良；右侧胸膜局部增厚(图1)；PPD试验强阳性，胸水常规：外观为乳糜样浑浊液体，比重1.04，李凡他试验阳性，胸水细胞总数27740/L，胸水白细胞数13740/L，多核细胞74%，单核细胞26%。胸水生化：腺苷脱氨酶(ADA)52U/L，乳酸脱氢酶862.8U/L，糖1.17mmoL/L，蛋白6260mg/dL；胸水甘油三酯1.74mmoL/L，胸水胆固醇10.37mmoL/L，胸水涂片抗酸染色及痰涂片抗酸染色3次均阴性；胸水mNGS提示MTB，序列数23，基因组覆盖度6.746387%，丰度26.417%，深度1.12，考虑结核性脓胸，给予头孢西丁联合左氧氟沙星抗感染，口服异烟肼、利福平、乙胺丁醇、吡嗪酰胺，引流胸水冲洗胸腔，2020年9月27日复查胸部CT提示右侧胸水明显减少，两肺炎症，不除外肺结核(图2)。

图1 例1患者2020年9月21日胸部CT影像

图2 例1患者2020年9月27日复查胸部CT影像

2.2病例2:患者男性，60岁，2018年体检时发现胸腔积液，遂于外院行胸腔穿刺引流胸水，诊断未明确。2020年9月30日于我院体检行胸部CT提示左肺上叶占位性病变伴周围阻塞性炎症，新生物不除外；右侧大量胸腔积液；右肺下叶膨胀不全。患病以来无不适。既往糖尿病史30年。查体：消瘦，营养不良，慢性病容，右肺叩诊浊音，右侧呼吸音减低。辅助检查：血常规：白细胞绝对值3.56×109L-1，中性粒细胞绝对值2.4×109L-1；血生化：ALB 28.3g/L。于2020年10月23行右侧胸腔穿刺置管引流，胸水常规：外观黄色微浊，比重1.032，李凡他试验阳性，细胞总数5113/L，白细胞613/L，多核细胞87%，单核细胞13%。胸水生化：ADA 14.8U/L，蛋白2000.7mg/dL，乳酸脱氢酶430.2U/L，糖0.7mmoL/L。PPD试验阳性。2020年10月27日胸部CT：左肺上叶占位较前增大，内伴有空洞形成，考虑肺癌不除外(图3)。行气管镜检查于右上叶前、后段及左上叶后段生理盐水灌洗。经超声小探头探查左上叶后段，远端可见管周不规则低回声区，于此处活检送检病理，未见癌细胞。2020年11月3日，BALF mNGS：MTB复合群(序列数62，丰度2.53%)，嗜肺军团菌(序列数1，基因组覆盖度0.002237%，丰度0.041，深度1)。后气管镜刷片涂片抗酸染色：抗酸染色3+。给予美罗培南联合左氧氟沙星抗感染，考虑临床诊断“肺结核，结核性胸膜炎”。

图3 例2患者2020年10月27日胸部CT影像

2.3病例3:患者男性，25岁，2020年11月无诱因出现干咳，伴午后发热，体温波动在37.5～38.5℃之间，伴乏力、纳差、盗汗。就诊于我院发热门诊，2020年11月16日胸部CT：左肺下叶炎性实变，左侧胸腔积液，心包少量积液。考虑“肺炎”，给与“左氧氟沙星”0.5g，每日一次，口服4d，患者发热、咳嗽未见好转，收入我科。患者自发病以来体重减轻5Kg。吸烟指数50。查体：体温38.5℃，左下肺叩诊浊音，左下肺呼吸音减低。辅助检查：红细胞沉降率85mm/60min，C反应蛋白141.9mg/L，血常规：白细胞绝对值8.87×109L-1，中性粒细胞绝对值6.23×109L-1。降钙素原0.137ng/mL，血清CA125 401.6U/mL，2020年11月24日复查胸部CT：较11月16日胸部CT左肺下叶炎性病变基本吸收，双侧胸腔积液，左侧较前增多，右侧新出现；双侧胸膜增厚；双肺下叶部分膨胀不全，新出现；心包积液较前增多(图4)。胸水常规：外观橘黄色浑浊，比重1.036，李凡他试验阳性，细胞总数1742/L，白细胞数1442/L，多核细胞14%，单核细胞83%。胸水生化：腺苷脱氨酶74.3U/L，蛋白4182.9mg/dL，乳酸脱氢酶1017.2U/L，白蛋白30.8g/L，糖5.9mmoL/L。2020年11月26日胸水mNGS：MTB复合群(序列数1，丰度100%)。胸水涂片抗酸染色阴性。胸水病理未见癌细胞。PPD试验强阳性。2020年12月1日行左侧内科胸腔镜检查，术中可见胸膜腔脏、壁层胸膜广泛粘连，以下肺为著，脏、壁层胸膜轻度充血，散在白色粟粒样结节，部分胸膜表面有纤维素样物附着(图5)。给予左氧氟沙星、乙胺丁醇、利福平、异烟肼、吡嗪酰胺口服抗结核治疗。患者体温逐渐降至正常。胸腔镜病理：(壁层胸膜小结节)上皮样肉芽肿性炎，小灶坏死，可见纤维素渗出，可疑结核。免疫组化结果：抗酸(+)，结合胸水mNGS结果，明确诊断为结核性胸膜炎。2020年12月9日复查胸部CT双侧胸水较前明显吸收(图6)。

图4 例3患者2020年11月24日胸部CT影像

图5 例3患者胸腔镜下表现依次为：胸膜粘连；脏层胸膜白色粟粒样结节及粘连；壁层胸膜白色粟粒样结节

图6 例3患者2020年12月9日胸部CT影像

2.4病例4:患者男性，77岁，2020年3月因“肠梗阻”于我院保守治疗后症状部分好转，此后出现咳嗽、咳白痰，伴憋气、乏力，2020年4月22日突发言语不清及左侧肢体无力，CRP 139.37mg/L，白细胞绝对值4.86×109L-1，中性粒百分比86.3%。胸部CT：右主支气管痰栓；两肺感染；左肺上叶多发磨玻璃密度结节，双侧胸膜增厚(图7)。头颅MRI未见异常。给予头孢唑肟联合依替米星抗感染。患者近4月体重下降10Kg。既往高血压、糖尿病，吸烟指数800。入院后患者体温最高38.4℃，给予美罗培南联合甲硝唑抗感染治疗，体温未见下降，伴寒战，肝功能恶化、I型呼吸衰竭，病情危重，转入呼吸重症监护室，无创呼吸机辅助通气，将抗生素调整为美罗培南联合左氧氟沙星，2020年4月27日行支气管镜检查，肺泡灌洗液送mNGS检测，镜下间左下叶外后基底段间嵴处新生物，支气管感染，气道内痰栓。活检病理：鳞状上皮乳头状增生，部分细胞中-重度异性增生，局灶呈原位癌，不除外浸润。T-SPOT检测阳性。BALF送检mNGS：肺炎克雷伯菌(序列数117，丰度0.8%)，金黄色葡萄球菌(序列数11，丰度0.1%)，白色念珠菌(序列数2906，丰度93.3%)，MTB复合群(序列数4337，丰度99%)，其后化验回报气管镜吸痰培养：白色念珠菌，BALF涂片抗酸染色(+)。患者出现DIC，考虑肺结核诊断明确，合并真菌、细菌多重重症感染。

图7 例4患者2020年4月22日胸部CT影像

2.5文献复习

2.5.1一项前瞻性研究纳入临床怀疑活动性结核病的患者34例，根据mNGS测序、传统方法、Xpert结果分析，以临床诊断为金标准，共19例确诊活动性结核患者，其中结核性脑膜炎8例，结核性胸膜炎3例，肝脏结核2例，皮肤软组织结核2例，腰椎关节结核2例，结核性腹膜炎1例，肺结核2例。mNGS敏感度为57.9%(11/19)，传统方法敏感度为31.6%(6/19)，特异度均为100%，两者差异无统计学意义(McNemar检验，P=0.180)。mNGS和Xpert两者的敏感度分别为50.0%(8/16)与37.5%(6/16)，特异度均为100%(15/15)。两者比较差异无统计学意义(McNemar检验，P=0.727)[2]。

2.5.2一项回顾性分析208例肺外标本涂片阴性但提示肺外结核(EPTB)的患者，从患者疑似感染部位收集标本进行结核培养、Xpert和mNGS检测。最终诊断为EPTB患者180例(结核性淋巴结炎47例，结核性脑膜炎45例，结核性胸膜炎42例，骨关节/脊柱结核15例，结核性腹膜炎12例，泌尿生殖系结核11例，结核性心包炎8例)。传统培养、Xpert和mNGS灵敏度分别为：13.89%(25/180,95%CI 9.36～20.01)、36.11%(65/180,95%CI 29.19～43.63) 和 56.11% (101/180,95%CI 48.53～63.43)。培养和Xpert联合诊断灵敏度为37.78%，mNGS比传统培养和Xpert联合诊断的灵敏度还要提高18.3%。 不同类型EPTB的mNGS敏感性差异显著，mNGS在结核性脑膜炎中检测敏感性最高(38/45，84.44%)。

2.5.3一项包括确诊和临床诊断结核患者共125例，肺外标本最多[57.6%(72/125)]，其中，浆膜腔积液34例(27.2%，胸腔积液31例，腹腔积液3例)，肺外组织22例(17.6%)，脓液标本10例(8.0%)，其他标本6例(4.8%，血液3例，分泌物2例，脑脊液1例)。肺内标本中痰液23例(18.4%)，BALF 21例(16.8%)，肺组织9例(7.2%)。mNGS总体敏感度为49.6%(95%CI 40.6～58.6%),特异度为98.3% (95%CI 96.9～99.1%)，肺组织mNGS检测敏感度最高，达到88.9%(95%CI 50.7～99.4%)，其次为肺泡灌洗液(BALF)为55.0%(95%CI 32.0～76.2%)，再次为浆膜腔积液为50.0%(95%CI 32.8～67.2%)。mNGS结核菌检出的总体敏感度优于传统培养方法(35.2%，95%CI 27.0～44.3)，但对痰液标本mNGS的敏感性与传统培养差异没有统计学意义(mNGS：52.3%，95%CI 31.1%～72.6%；传统培养方法： 60.9%，95%CI 38.8～79.5%)。在确诊和临床诊断50%的病例中，mNGS检测结果MTB复合群序列数都偏低，在小于5条的范围内。mNGS将MTB检测周期缩短至32～36h[3]。

2.5.4一项前瞻性研究对105例疑似活动性结核感染患者的痰，脑脊液、脓液等样本同步进行传统培养、Xpert和mNGS检测。有45人最终临床诊断为活动性结核感染，包括了13例肺结核和32例肺外结核病例。以临床最终诊断为标准，mNGS对活动性结核诊断的敏感度为44%，与Xpert方法的敏感度(42%)相似，但远高于传统方法的敏感度(29%)。mNGS对活动性结核诊断的特异度达98%，只有一个假阳性结果。mNGS对治疗前取得的临床样本诊断的敏感度显著高于治疗后，分别为76%和31%(P=0.005)，Xpert和传统培养也是如此。Xpert和mNGS联合诊断活动性结核的敏感度可达到60%，明显高于传统方法(McNemar检验，P<0.001)。

2.5.5在另一项收集了70例疑似结核病例的研究中，评估了mNGS、传统培养方法和Xpert之间的诊断性能、关系和一致性。研究提示在最终确诊的36例样本中，mNGS的敏感性、特异性、阳性预测值、阴性预测值和约登指数分别为66.7%(95%CI:0.489～0.809)、97.1%(95%CI:0.829～0.998)、96.0%(95%CI:0.777～0.998)、73.3%(95%CI:0.578～0.849)、63.8%。mNGS的敏感性明显优于常规培养法(66.7%，95%CI:0.489～0.809 vs.36.1%，95%CI:0.213～0.538)和Xpert(76.9%，95%CI:0.460～0.938 vs.61.5%，95%CI:0.323～0.849)。与肺外结核相比，肺内结核病例 mNGS、传统培养和Xpert都显示出更好的结核诊断能力。在所有方法和样本分类中，肺内样本平行诊断试验的Youden指数表现突出(mNGS/培养88.2%；mNGS/Xpert100%)。各类型标本mNGS与传统培养的相关性及一致性均有统计学意义(P<0.001)[4]。

2.5.6一项前瞻性单中心研究，收集疑似为活动性肺结核共110例患者，对BALF同时进行mNGS和Xpert、抗酸染色(AFS)、传统培养，临床最终确诊为肺结核患者为48例。mNGS诊断的敏感性为47.92%，与Xpert(45.83%)和培养(46.81%)相似，但远高于AFS(29.17%)；mNGS还可检测出肺结核患者混合感染，其中真菌3例，细菌1例。同时，mNGS对63.63%(14/22)的NTM、7例真菌、1例病毒及其他常见致病菌进行了有效鉴定；mNGS在3d内可鉴别67.23%的感染病原菌，而常规微生物检测方法(包括培养、血清学方法、PCR等)在90d内只能识别49.58%的病原菌[5]。

3 讨 论

长久以来，结核的诊断依赖于传统培养、涂片抗酸染色，但传统培养法周期较长，通常2～8周，而且需要生物安全防护Ⅲ级的实验室。而NTM、奴卡菌属、micdadei军团菌抗酸染色也可阳性，因此涂片抗酸染色阳性并不能确定一定为结核菌感染，近年来Xpert被WHO强烈推荐应用于疑似结核检测，仅需5个纯化DNA基因片段或131个菌落/mL即可检出，2h就可出报告，还可同时检测利福平耐药，且目前研究认为NTM感染不会导致Xpert假阳性[6]。本研究病例1及2患者临床症状不典型，最终依据胸腔积液或BALF mNGS测序得以诊断MTB感染。病例3患者病理提供结核确诊依据，胸水mNGS检出MTB复合群序列数仅为1，但根据多篇文献报道，由于MTB为胞内细菌，胞内生长为其特性，释放较少的胞外核酸，同时细胞壁坚韧，DNA提取困难，因此mNGS检测起始DNA量即偏低，导致了检测困难，但其环境污染风险低，因此即使在检测报告中序列数较低，也要考虑其为致病微生物的可能[7]。病例4患者mNGS同时检测到细菌、真菌、MTB，为混合重症感染，mNGS检测可敏感、快速、精准、无偏倚的捕捉混合感染病原体，缩短了危重感染患者的诊断周期，为积极救治争取了宝贵的时间。并且在样本抗酸染色阳性时，mNGS可高效鉴别MTB与NTM，避免误诊误治。由于MTB菌群内的菌株内部同源性高，本研究病例2、3和4由于mNGS检测基因组覆盖度不高，MTB复合群阳性，但无法定位到特定种。

综合本研究文献复习，mNGS无论是对肺外或肺内标本，其总体敏感度优于传统结核菌培养法，在检测临床样本时不需要根据高度怀疑的某些病原体选择特定的检测方法。mNGS检测结核菌敏感度及特异度与Xpert相似或优于Xpert，但需要强调的是抗结核治疗可显著降低mNGS、Xpert、传统培养三种诊断方法的敏感度，因此在经验性治疗前收集样本是非常重要的。与肺外结核病例相比，肺内结核病例采用mNGS、传统培养和Xpert方法三者均显示出更好的诊断能力。肺外结核患者中，mNGS诊断的敏感度最高，甚至高于传统培养联合Xpert。尤其是当mNGS与Xpert联合时，可提高结核菌检出率，无论时从时间周期还是敏感度及特异度方面，均可达到较高水平。在确诊病例中，mNGS结核菌检出阳性率明显高于临床诊断病例。

mNGS对肺内样本结核菌检测更为敏感，肺组织标本敏感度最高，其次为BALF，再次为浆膜腔积液，但在痰标本中与传统培养相比差异没有统计学意义，因此选取肺内标本时，在病情允许情况下应优先考虑肺组织，其次为BALF，再次为胸腔积液，最后选择痰标本。mNGS在对标本量的要求方面也更加具备优势，分别为：无菌体液最少2mL；BALF最少4mL；深部痰液最少2mL；静脉血最少2～5mL；组织标本新鲜组织2g左右。而Xpert要求脑脊液至少3.4mL，且往往要高于这个临界值检测效能才会理想，而胸腹水至少80mL。因此mNGS方法更适用于稀有样本的检测。

综上所述，mNGS技术对于诊断MTB感染具有较高的价值，mNGS敏感度较高，优于Xpert及传统培养，三者或mNGS分别与Xpert或传统培养联合应用不仅可显著提高结核菌检测的敏感度，而且可缩短检测周期，无偏倚检测混杂、新发或再发病原体感染，精准治疗，避免抗生素滥用。