亚甲基四氢叶酸还原酶基因多态性在产前筛查前的性能验证

张艳秋

【关键词】 亚甲基四氢叶酸还原酶基因;产前筛查;PCR+ 金标免疫层析法;性能验证

随着二胎政策放开，高龄孕妇与日俱增，这不仅仅要求医师提高剖宫产的手术技能，减少孕产妇死亡率，更为检验科工作人员和临床医师敲响警钟，如何联合协作做好产前筛查，降低新生儿畸形和死亡率。出生缺陷影响着新生儿的生存和后续生活，也对新生儿家庭产生难以抹去的阴影，更给社会造成了巨大的负担。现今，新生儿缺陷难以有效治疗，所以临床上多采取产前筛查的方法预防新生儿缺陷发生。大量研究已经证明，亚甲基四氢叶酸还原酶（RecombinantMethylenetetrahydrofolate Reductase， MTHFR） 基因是叶酸代谢通路中的关键代谢酶，亚甲基四氢叶酸还原酶缺陷可以导致5- 甲基四氢叶酸合成减少，通过体内生化变化最终导致叶酸水平降低和发生高同型半胱氨酸血症（Hyperhomocysteinemia，Hhcy）。同型半胱氨酸会影响破坏血管内皮，Hhcy 患者的凝血与纤溶系统常因平滑肌细胞受到血管内皮损伤的刺激而破坏，因此导致患者处于血栓前状态。同型半胱氨酸也是许多疾病的独立危险因素，主要在表现在妇幼保健筛查（ 如神经管缺陷、先天性心脏病、唇腭裂、妊高症等）、肿瘤（ 乳腺癌、胃癌、肝癌、儿童急性白血病等）、心脑血管疾病三大主要方面。我们把工作的焦点放在妇幼保健，分析产检孕妇的亚甲基四氢叶酸还原酶基因变异情况，同期结合遗传、环境等多方面因素建立起本地区有关MTHFR 基因多态性与产前筛查相关性分析。这个检测项目对于可能出现的高同型半胱氨酸和叶酸的异常代谢和缺乏给予适当的预防、适量的补充，有助于指导孕妇服用叶酸，降低唐氏综合症、唇腭裂、神经管缺陷等新生儿缺陷;做到早发现、早预防[1]。近些年来，亚甲基四氢叶酸还原酶基因（MTHFR C677T） 多态性应用于产前筛查已初步通过验证，但依据《医学实验室质量和能力认可准则》（ISO15189：2012， IDT）[2] 和《医疗机构实验室管理办法》的相关规定，在开展该项目前，必须行方法学验证，以确保检测结果的可靠性。

1 资料与方法

1.1 一般资料 MTHFR C677T 基因检测样本来自2017 年期间门诊进行产前筛查的孕妇。样本为EDTA 抗凝剂的静脉全血，EDTA 抗凝剂的全血样本所抽提的DNA 样本（DNA 的浓度不低于5 ng/?L）A260/A280 应在1.6～2.0 之间。

1.2 方法 1.2.1 样本DNA 的制备 按照全血基因组DNA 提取试剂盒使用说明书分离全血中的基因组DNA。

1.2.2 PCR 扩增液准备 ①取无菌0.2 mL PCR 薄壁管两支并将M、WT 分别标注于管盖上，以便于为每份样本分别进行两种反应。②从-20℃的环境中将试剂取出并置于外界环境中升至室温，瞬时离心。分别将29?L 扩增液（M）、扩增液（WT） 加入标记有M 和WT 的薄壁管中。③准确量取1?L 反应液分别加入上述两个薄壁管中，其后将管盖盖紧并混合均匀，置于离心机中瞬时离心，其后取出放置一旁待用。

1.2.3 待检测DNA 样本的配制 分别准确量取3?L 对待测基因组DNA 加入上述离心后的两个薄壁管中，为使混合后的体积达到50?L，应分别量取17?L ddH2O 加入薄壁管中，其后将管盖盖紧并混合均匀，置于离心机中瞬时离心以备后续操作。

1.2.4 PCR 扩增 打开PCR 仪并将PCR 管置于其中，依照50℃ 2 min;95℃ 5 min;94℃ 30 sec、60℃ 30 sec、65℃1 min（26Cycles）;65℃ 10 min;4℃ Hold 程序進行扩增。操作完成后，将扩增后的产物取出移至2℃～8℃环境中进一步保存以备后续操作。

1.2.5 检测卡检测实验 从密封袋中取出检测卡，分别在对应的样品垫上滴加上述两个薄壁管中的扩增产物，静待2～5 min 判读检测结果，为保证结果的准确性，应确保在20min 内完成判读。

1.2.6 结果判读 将待测样本M 与WT 管中的PCR 产物进行滴加检测，在检测结果中，C677T 位点的基因型主要是依据是否有条带出现而判定的。具体观察检测卡T 线处是否有条带，若两管中的产物均有，为杂合突变型（677CT 型）;若WT 管产物有而M 管产物无，为野生型（677CC 型）;若M 管产物有而WT管产物无，为纯合突变型（677TT 型）。无效判定：检测卡变质或错误操作可导致指控线（C 线） 不出现条带。针对上述情形，应更换合格的检测卡并准确依照说明书进行再次操作。

1.2.7 质量控制 ①在阳性对照卡上有条带出现则为阳性对照，反之，在阴性对照卡上无条带出现则为阴性对照。应确保定期针对上述两种对照品进行实验。②阳性对照品实验：取无菌0.2 mL PCR 薄壁管两支并将M、WT 分别标注于管盖上，分别准确量取20?L M 阳性对照液与WT 阳性对照液加入相同标注管中，其后分别量取1?L 反应液+29?L M扩增液、1?L 反应液+29?L WT 扩增液加入对应的薄壁管中，并重复上述PCR 扩增、检测、判读步骤，条带出现在T线与C 线处。③阴性对照品实验：取无菌0.2 mL PCR 薄壁管两支并将M、WT 分别标注于管盖上，分别量取1?L 反应液+29?L M 扩增液、1?L 反应液+29?L WT 扩增液加入对应的薄壁管中，准确量取20?L 阴性对照液加入其中，并重复上述PCR 扩增、检测、判读步骤，T 线处无条带而C 线处有条带。

对于检测结果中，依据文献和临床研究报道：当MTHFRC677T 发生纯合突变则酶活性降低，对叶酸的吸收代谢产生影响;MTHFR C677T发生杂合突变则酶活性中等，对叶酸代谢吸收产生一定影响;MTHFR C677T 不发生突变即野生型则酶活性高，叶酸代谢吸收正常。具体资料见表1。

2 结果

2.1 方法学性能评价

2.1.1 基因型各浓度样本的检出率 评价方案：选取MTHFR 677CC 型（ 野生型）、MTHFR 677CT 型（ 杂合突变型）、MTHFR 677TT型（ 纯合突变型） 样本，分别检测两个不同浓度5 ng/μL 和10 ng/μL，按照不同浓度，上述三种基因型分别进行3 次检测，统计各基因型各浓度样本的检出率。具体资料见表2。

判定标准：检出率达100% 的最低样本浓度即为本实验方法的检测下限。

验证结果：浓度为5ng/uL 时，检出率100%，条带清晰、明确。

2.1.2 符合率实验 评价方案：取已知MTHFR 基因型DNA 样本20 例（ 覆盖MTHFR 三种基因型），编盲后进行MTHFR 基因型检测（ 在阴、阳性质控在控的情况下对结果进行评价分析），检测结果与已知的第三方双向测序结果比对，比较二者的符合率。

判定标准：总体符合率95% 为判断标准。

验证结果：共测序比对20 例。其中，CC 型6 例，CT 型7例，TT 型7 例。CC 符合率100%，CT 符合率100%，TT 符合率100%，總符合率100%。

2.1.3 精密度实验 评价方案：选取MTHFR 677CC 型（ 野生型）、MTHFR 677CT 型（ 杂合突变型）、MTHFR 677TT 型（ 纯合突变型） 样本，持续测试5 d，每个样本每天重复3 次。

具体资料见表3。

判定标准：检测每天重复结果，基因型符合率大于95%为判断标准。

验证结果：5 d 实验结果比对总符合率100%。

2.2 本文性能验证项目 采用PCR+ 金标免疫层析法的快速分析技术，以金磁微粒为标记载体，建立了MTHFR C677T基因快速层析检测系统。在实验室项目评估中，精密度指提示结果的一致性，准确度衡量结果与真值之间的关系，而好的精密度与良好的准确度相关。这两者都是评估实验室项目的重要组成部分。本次性能验证的结果表明：该方法具有高精密度和符合率，在临床应用中的安全性和有效性均能保证。该检测方法与其他方法相比也拥有许多优势。首先，该产品具有独特的设计原理，不仅操作简单，而且快捷，比芯片法节约近3 个小时，比测序法更节约时间，可以高通量测试，时间和人力成本明显节约，结果准确，可以满足大型医疗机构对基因型检测样本量较大的要求。UNG 酶的采用，避免了PCR 产物进行层析检测过程中的污染发生。同时，该试剂盒使用过程中无需大型测序仪器，无需专业的生物芯片杂交仪和扫描仪等，只需要普通的PCR 测序仪，就可以完成对MTHFR C677T 位点的基因检测，这一点也解决了三级以下医院设备简陋的问题，有利于检测项目在小医院的开展，很大程度也方便了孕妇进行产前检查，有助于项目的普及。MTHFRC677T 多态性检测试剂盒的性能验证结果与厂商提供的数据基本一致。经性能验证实验证明该试剂盒基本满足对产妇进行产前筛查的要求，可以应用于临床检测。

3 讨论

妇幼保健方面，针对中国人的相关亚甲基四氢叶酸还原酶基因多态性主要集中在MTHFR 基因C677T 的位点多态性研究上[3-4]，这是毋庸置疑的。本报告虽然对实验方法学性能作了评价，结果显示检测下限、符合率、精密度、准确性均符合要求。但临床诊断性能包括临床特异性、敏感性、阳性预测值、阴性预测值、似然比、一致性等临床诊断性能，这也是今后计划工作的一部分。每一种实验方法都存在假阴性和假阳性，假阴性高表示漏诊率高。样本采集的问题也是假阴性重要因素，而更应该引以关注的是某项指标阳性与实际发病的关系。实验中也应尽可能继续结合遗传因素、环境回素、自身免疫状况及食物营养等多因素与产前MTHFRC677T 基因检测综合分析新生及孕妇可能发生的各种状况。

MTHFR C677T 突变与新生儿缺陷有关，但不是唯一的致病因素，MTHFR C677T 多态性检测这一性能评价也仅仅是产前筛查的一个质量保证，多指标联合检测也是减少漏诊的重要方法[5-6]。其结果的判读应用在于提示同型半胱氨酸的升高和叶酸的降低，才能对可能出现的高同型半胱氨酸和叶酸的异常代谢和缺乏给予适当的预防、适量的补充，有助于指导孕妇服用叶酸，及时干预，对避免新生儿缺陷有重要意义。