miRNA-200s介导SEC23A调节的分泌蛋白组对慢性阻塞性肺疾病(COPD)EMT的影响及机制研究

2021-09-10 19:23朱敏陆建萍高静来依宁吴叶菊卡米拉黄丽欢
中国药学药品知识仓库 2021年3期
关键词:靶点靶向调节

朱敏 陆建萍 高静 来依宁 吴叶菊 卡米拉 黄丽欢

摘要: 目的 探讨miRNA-200s介导的SEC23A调节的分泌蛋白组对EMT的影响及机制。方法 荧光报告系统检测在气道上皮细胞中,miRNA-200s是否通过结合3′ UTR而调节SEC23A的表达。WS刺激Rat AECs和16HBE,使miRNA-200s过表达或者低表达,运用荧光共聚焦, RT-PCR,Western blot 和Sircol assay检测SEC23A和Col I的表达变化。另外,使SEC23A过表达或者siRNA,观察是否出现EMT的改变。运用荧光共聚焦, RT-PCR,Western blot 和Sircol assay检测Col I的表达变化。结论 在COPD的SAR发生发展中,miRNA-200c可以靶向调节SEC23A介导的Collagen I分泌,这种分子调节进而对EMT产生影响,该过程将成为SAR发生分子机制的一条新型信号途径,可能成为COPD治疗的一个有效干预靶点。

关键词:miRNA-200s SEC23A 慢性阻塞性肺疾病(COPD) EMT

【中图分类号】R322.3 【文献标识码】A 【文章编号】2107-2306(2020)01-092-01

在COPD的发生发展过程中,小气道重塑(Small Airway Remolding, SAR)形成是COPD气流阻塞的主要病理学基础,是COPD病变持续发展的关键因素【1】。本文旨在探讨miRNA-200s介导的SEC23A调节的分泌蛋白组对EMT的影响及机制,研究如下:

(1)研究内容

探讨miRNA-200s介导的SEC23A调节的分泌蛋白组对EMT的影响及机制。

(2)研究目标

①明确参与SAR的miRNA-200s亚型,探讨该亚型以及SEC23A表达改变,及其与SAR的相关性。

②探讨miRNA-200s通过对SEC23A介导的分泌蛋白组的靶向调节对EMT的影响和分子机制,评估该新型信号途径是否可能成为COPD治疗的一个有效干预靶点。

(3)拟解决的关键科学问题

①明确miRNA-200s在SAR发生发展中的作用,鉴定新的参与调节SAR发生发展的关键靶基因和通路。

②阐明miRNA-200s通过对SEC23A介导的分泌蛋白组的靶向调节对EMT的影响和分子机制。

(4)实验结果

实验结果一:

①首先采用Targetscan软件分析结果显示,miRNA-200s含有和Sec23a基因的3’UTR结合的保守位点。

②构建SEC23A 3’UTR荧光素酶报告基因质粒(野生型和突变型),与miRNA-200c 模拟物共转染,荧光报告系统检测荧光素酶的活性,荧光素酶报告基因实验结果证实,共转染野生型SEC23A 3’UTR荧光素酶质粒和pre-miRNA-200c,与其他各组相比,荧光素酶活性明显降低,差异有统计学意义,P<0.01。

实验結果二:

①SEC23A对Collagen I分泌的调节:在Sec23a基因敲除的胚胎间充质细胞中转染SEC23A-GFP使SEC23A过表达,结果显示过表达SEC23A的细胞可以促进Collagen I分泌到细胞外,呈现典型的纤维丝状结构。而没有过表达SEC23A细胞则使Collagen I不能分泌出细胞。在培养的胚胎成纤维细胞中,正常成纤维细胞可以将Collagen I分泌到细胞外呈纤维状,而完全敲除Sec23a基因则导致分泌到细胞外的Collagen I减少,细胞间隙完全没有Collagen I沉积。Sec23a敲除导致Collagen I分泌减少负反馈调节引起Collagen I合成进一步减少。

②SEC23A表达改变对EMT的影响:WSC刺激16HBE,使SEC23A过表达或者siRNA,蛋白印迹结果显示SEC23AsiRNA促进细胞上皮型标记蛋白E-cat表达上调,间质型标记蛋白Vimentin表达下调,说明SEC23AsiRNA抑制EMT现象的发生,上皮表型转化成纤维细胞样的间质表型减少,从而促进Collagen I的分泌减少,而SEC23A过表达促进EMT发生,Collagen I的分泌增加。

讨论

Col I的蛋白合成后转入到内质网(endoplasmic reticulum,ER),经过正确折叠的蛋白经过COPII(Coat protein complex II ,COPII)转运到高尔基体进行进一步修饰,最终分泌到细胞外。COPII由SAR1,SEC23–SEC24复合体,以及SEC13–SEC31复合体五种成分组成,负责将大部分分泌蛋白从ER转运到高尔基体。SEC23在COPII中发挥关键性作用,分为SEC23A和SEC23B两个亚型。其中SEC23A可以加速细胞外基质蛋白从ER到高尔基体的转运,担负着这些蛋白的分泌和合成的功能【2】。我们结合前期实验和研究进展,推测SEC23A可能通过介导Col I 的合成和分泌,进而调节EMT,从而在COPD的SAR中发挥重要作用。miRNAs调节很多分子和细胞过程。异常miRNAs表达可以导致很多病理性疾病的发生和发展。特别是miRNA-200s可以特异性抑制SEC23A的表达,进而调节SEC23A介导的分泌蛋白组(Secretome),在乳腺肿瘤的转移中发挥重要作用【3】。基于TGF-beta刺激肺泡上皮形成的肺纤维化模型中miRNA-200s下调,Sec23a表达明显上调,我们推测在COPD的SAR发生发展过程中,miRNA-200s可能调控SEC23A的表达。结论,在COPD的SAR发生发展中,miRNA-200c可以靶向调节SEC23A介导的Collagen I分泌,这种分子调节进而对EMT产生影响,该过程将成为SAR发生分子机制的一条新型信号途径,可能成为COPD治疗的一个有效干预靶点。

该项目获得新疆维吾尔自治区自然科学基金面上项目(项目编号:2016D01A020)支持

参考文献:

[1]Hogg JC, Chu F, Utokaparch S, Woods R, Elliott WM, et al. The nature of small-airway obstruction in chronic obstructive pulmonary disease. New England Journal of Medicine2004; 350: 2645–2653.

[2]Ishikura-Kinoshita S, Saeki H, Tsuji-Naito K. BBF2H7-mediated Sec23A pathway is required for endoplasmic reticulum-to-Golgi trafficking in dermal fibroblasts to promote collagen synthesis J Invest Dermatol 2012, 132:2010–2018.

[3]Korpal M1, Ell BJ, Buffa FM, Ibrahim T, Blanco MA, Celià-Terrassa T, Mercatali L, Khan Z, Goodarzi H, Hua Y, Wei Y, Hu G, Garcia BA, Ragoussis J, Amadori D, Harris AL, Kang Y. Direct targeting of Sec23a by miR-200s influences cancer cell secretome and promotes metastatic colonization. Nat Med. 2011 Aug 7;17(9):1101-8.

作者简介:

朱敏(1978.8)女;汉族,湖北武汉,主任医师,博士;研究方向:呼吸与消化病理及精准医疗。

(克拉玛依市中心医院 834000)

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