蒙药森登-4对CIA大鼠CTLA-4/B7-1介导免疫炎症的初步研究

刘晓琼，李志茹，胡 宾，沈敬华

（1.内蒙古医科大学基础医学院，内蒙古 呼和浩特010059；2.内蒙古医科大学中医学院）

类风湿关节炎（Rheumatoid arthritis，RA）易引起多关节炎症，严重时会引起关节畸形，甚至功能丧失[1]。近年来，越来越多研究表明RA与免疫反应失衡有关[2]，RA免疫反应同细胞因子相关，细胞因子释放过量会导致T细胞活化过度[3]。目前最受关注的调节分子是CTLA-4、PD-1。T淋巴细胞活化后，快速表达T淋巴细胞相关蛋白4（CTLA-4），CTLA-4可以同CD28竞争性结合B7-1/B7-2，以下调免疫应答，从而限制T细胞增殖，使效应T细胞失活，达到免疫平衡恢复[4]。关于RA相关的免疫细胞和细胞因子的研究为RA的治疗提供了指导[5]。目前，市面上常用的治疗RA药物具有一定副作用，而免疫抑制剂由于经济和自身免疫耐受的影响，也限制了其临床应用[6]。

蒙药西拉.森登（Xira.Sendeng）-4又称蒙药四味文冠木汤，是抗风湿的经典药方，在《中华人民共和国药典蒙药分册》中记载，由文冠木、川楝子、诃子、栀子（以5：3：1：1比例）构成，具有清热、消肿、燥协日乌素等作用[7，8]。森登-4在实验中不仅被证实可以调节免疫平衡以治疗CIA[9]，而且在临床RA治疗中有一定疗效[10，11]。本研究利用大鼠类风湿关节炎模型（CIA），观察森登-4治疗后IL-6、TGF-β、sCTLA-4和B7-1（sCD80）的水平，探究森登-4对CTLA-4/B7-1介导的免疫炎症相关性。

1 材料和方法

1.1 实验动物

Wistar大鼠48只，雄性和雌性各24只，4.5～5.5周龄，体质量约168 g，购于内蒙古医科大学，合格证号：SCXK（蒙）2015-0001。动物实验室饲养，室温21℃～24℃。实验过程对大鼠的处理符合动物伦理学标准，已通过实验动物伦理审查。

1.2 实验药物

药名甲氨喋呤片森登-4汤厂家上药信宜平内蒙古国际蒙医医院批号H31020644 20190802

1.3 实验试剂

试剂名牛II型胶原蛋白弗氏完全佐剂硝酸甲醛乙酸IL-6 ELISA试剂盒TGF-βELISA试剂盒sCTLA-4 ELISA试剂盒sCD80 ELISA试剂盒抗CTLA-4抗体抗CD80抗体中性树胶苏木染色液95%酒精PBS磷酸盐缓冲液伊红通用型SP kit DAB kit厂家索莱宝公司Sigma公司北京化工厂风船化学麦克林公司睿信生物睿信生物睿信生物睿信生物博士德生物博士德生物中衫金桥中衫金桥文水大有中衫金桥青药生物中衫金桥中衫金桥批号Lot.No.809L051 F5881，1002804381 20170728 20190826 A801299 20191125003 20191125003 20191125003 20191125003 ZP7611BP11 ES092BP92F ZLI-9555 ZLI-9609 20191015 ZLI-9061 HB0107 SP-9000 ZLI-9017

1.4 实验仪器

名称游标卡尺电子秤动物DR脱水机平衡离心机石蜡切片机烤片机冰台石蜡包埋机全波段酶标仪显微镜水浴锅厂家或型号上海工量具有限公司SD168 CLEAVET.DR16 Thermo,EXCELSIOR AS湘仪离心机仪器RM2235 HI1210 Histolo Arcadiac Arcadia H Thermo，1510 Leica,DM3000 HWS-12

1.5 动物造模及给药

48只大鼠被随机分为6组：正常组，模型组，森登-4低、中、高剂量组和甲氨蝶呤组，每组8只。牛II型胶原蛋白溶入0.1 mmol/L醋酸，冷藏24 h；次日溶于等容积完全弗氏佐剂中，冰浴下充分混合乳化，混合液浓度为0.1 mg/L。在大鼠背部和尾根近1cm处酒精消毒后注射抗原；正常组被注射等容积生理盐水。7天后，采用上述方法加强免疫。造模后，森登-4低、中、高剂量组分别予1.0 g/（kg∙d），2.0 g/（kg∙d），4.0 g/（kg∙d）热水混匀后灌胃；甲氨蝶呤组予1.0 mg/（kg∙w）灌胃；正常组和模型组予等容积生理盐水灌胃，每天定时操作，疗程为3个，共27天。造模期间每天观察大鼠活动情况、精神状态、毛发光泽度，记录摄食情况、体重和右后足足爪厚度，并对大鼠关节炎指数进行评分，关节炎指数评分（见表1）。

表1 关节炎指数（AI）评分标准

1.6 ELISA法检测血清IL-6、TGF-β、sCTLA-4、sB7-1（CD80）水平

治疗3个疗程后，随即用10%水合氯醛0.3 mL/100g对大鼠行腹腔麻醉，取4～5 mL腹主动脉血，置于离心管中标记离心，离心后取其上清于EP管内，EP管编号放入冰箱保存，待检。根据试剂说明步骤操作，检测吸光度值，分别计算浓度。

1.7 HE染色

取血后处死大鼠，取大鼠右侧踝关节，编号标记放标本盒中，固定于4%甲醛溶液中24 h，14%硝酸避光脱钙72 h（用蒸馏水344 mL，将56 mL硝酸不断搅拌缓慢加入蒸馏水中，最终体积为400 mL）。脱钙后纵向分离踝关节，最后制备蜡块、切片、HE染色，显微镜下采图、读片。病理学评分标准（见表2）。

表2 踝关节病理学评分标准

1.8 免疫组化法检测踝关节CTLA-4、B7-1的表达

利用免疫组化法分别检测抗体CTLA-4、CD80（B7-1）在大鼠踝关节的表达情况，实际操作步骤根据试剂说明进行，最终在显微镜下读片，分别计算两种抗体的IOD值。

1.9 数据分析

使用SPSS 23.0软件分析数据，使用单因素方差分析法分析，采用LSD法或Dunnett T3法进行两两检验，检验水准为α＝0.05，所得结果P＜0.05，则认为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 一般状况

造模成功后，除外正常组，各造模组大鼠均出现活动减少、后肢肿胀明显、精神萎靡、毛发缺少光泽等情况。如表3所示，经治疗后，高剂量森登-4和甲氨喋呤可缓解以上症状。模型组造模后第14天有体重的明显降低（P＜0.05）；3疗程后，各药物治疗组比模型组的体重显著升高（P＜0.05）。

表3 大鼠体重变化观察（±s，n=8）(g)

表3 大鼠体重变化观察（±s，n=8）(g)

注：与正常组比较，*P＜0.05；与模型组比较ΔP＜0.05。

分组正常组模型组森登-4低剂量组森登-4中剂量组森登-4高剂量组甲氨喋呤组造模前175.63±7.596 172.75±9.721 173.13±10.021 171.38±9.812 176.75±4.862 174.88±9.819造模后7日192.38±6.046 180.25±8.548*182.25±16.464 181.50±14.639 181.75±10.166 184.50±6.256造模后14日220.88±12.563 190.00±10.542*192.75±15.773*197.50±19.574*201.00±14.995*200.75±11.973*3疗程结束260.25±13.477 210.50±13.617*225.75±17.597*Δ 235.13±11.606*Δ 249.25±11.094Δ 250.75±15.490Δ

如表4所示，同正常组相比，模型组造模后第14天时足掌厚度明显增厚（P＜0.05）；治疗3疗程后，同模型组相比，药物治疗组足掌厚度明显降低（P＜0.05）。

表4 蒙药森登-4治疗针对对大鼠足掌厚度的影响（±s，n=8）(mm)

表4 蒙药森登-4治疗针对对大鼠足掌厚度的影响（±s，n=8）(mm)

注：与正常组比较，*P＜0.05；与模型组比较ΔP＜0.05。

分组正常组模型组森登-4低剂量组森登-4中剂量组森登-4高剂量组甲氨喋呤组造模前3.15±0.045 3.16±0.038 3.17±0.041 3.14±0.060 3.18±0.039 3.19±0.066造模后第14天4.02±0.029 6.19±0.033*6.18±0.040*6.16±0.053*6.14±0.039*6.15±0.065*3疗程结束4.44±0.146 7.83±0.342*5.84±0.261*Δ 5.45±0.283*Δ 4.69±0.249Δ 4.65±0.201Δ

2.2 森登-4对大鼠关节炎指数影响

如表5所示，各造模组和正常组比较，在造模后第7天和第14天时AI明显升高（P＜0.05）；经过治疗3疗程后，药物治疗组AI比模型组降低，森登-4高剂量组和甲氨喋呤组缓解最明显（P＜0.05）。

表5 森登-4治疗对大鼠关节炎指数的影响（±s，n=8）

表5 森登-4治疗对大鼠关节炎指数的影响（±s，n=8）

注：与正常组比较，*P＜0.05；与模型组比较ΔP＜0.05。

分组正常组模型组森登-4低剂量组森登-4中剂量组森登-4高剂量组甲氨喋呤组造模后7天0.00±0.000 5.53±0.331*5.42±0.305*5.44±0.251*5.48±0.357*5.46±0.259*Δ造模后第14天0.00±0.000 8.50±0.269*7.78±0.788*7.84±0.767*8.20±0.223*8.43±0.223*Δ 3疗程结束0.00±0.000 10.14±0.336*6.04±0.336*Δ 5.54±0.336*Δ 4.28±0.616*Δ 4.04±0.440*Δ

2.3 森登-4对关节HE病理改变的影响

如表6、图1所示，3个疗程后，对比各组HE切片发现，造模大鼠的滑膜组织炎细胞浸润、纤维组织和滑膜组织增生均有显著升高（P＜0.05）；3疗程药物治疗后，治疗组比模型组的滑膜炎细胞浸润、滑膜组织和纤维组织增生评分则显著降低（P＜0.05）。森登-4高剂量组和甲氨蝶呤组变化最明显。

图1 各组大鼠踝关节HE染色图片（×200）

表6 蒙药森登-4治疗针对大鼠踝关节病理学评分的影响（±s，n=8）

表6 蒙药森登-4治疗针对大鼠踝关节病理学评分的影响（±s，n=8）

注：与正常组比较，*P＜0.05；与模型组比较ΔP＜0.05。

分组正常组模型组森登-4低剂量组森登-4中剂量组森登-4高剂量组甲氨喋呤组滑膜细胞增生0.00±0.000 2.75±0.707*1.63±0.518*Δ 1.50±0.535*Δ 1.38±0.744*Δ 1.25±0.707*Δ炎细胞浸润0.00±0.000 3.00±0.758*1.63±0.744*Δ 1.50±0.756*Δ 1.25±0.463*Δ 1.13±0.641*Δ纤维组织增生0.00±0.000 2.75±0.463*1.50±0.756*Δ 1.38±0.518*Δ 1.25±0.463*Δ 1.13±0.641*Δ

2.4 大鼠血清中IL-6、TGF-β、sCTLA-4和sB7-1（CD80）的水平

如表7所示，模型组IL-6、sCTLA-4的表达水平比正常组显著升高（P＜0.05）；3个疗程药物治疗后，各治疗组IL-6、sCTLA-4水平则比模型组明显降低（P＜0.05）。模型组TGF-β、B7-1浓度比正常组明显减少（P＜0.05）；而3个疗程药物治疗后，各治疗组则比模型组显著上调（P＜0.05）。其中治疗组森登-4高剂量组和甲氨蝶呤组表现尤为突出。以上结果说明森登-4和甲氨喋呤通过上调抑炎因子、下调促炎因子的水平缓解CIA大鼠的病情，并且治疗效果同药物剂量相关，呈剂量反应关系。

表7 大鼠血清IL-6、TGF-β、sCTLA-4和sB7-1(CD80)变化（±s，n=8）（pg/ml）

表7 大鼠血清IL-6、TGF-β、sCTLA-4和sB7-1(CD80)变化（±s，n=8）（pg/ml）

注：与正常组比较，*P＜0.05；与模型组比较ΔP＜0.05。

分组正常组模型组森登-4低剂量组森登-4中剂量组森登-4高剂量组甲氨喋呤组IL-6 47.00±2.016 105.66±15.441*78.24±13.191*Δ 74.71±10.916*Δ 71.02±8.422*Δ 71.64±9.048*Δ TGF-β 84.09±10.065 42.89±12.538*69.82±16.66Δ 72.94±17.219Δ 80.25±23.455Δ 78.25±16.701Δ sCTLA-4 138.57±25.708 374.84±44.600*275.48±24.592*Δ 245.82±26.713*Δ 209.57±20.760*Δ 195.90±24.216*Δ B7-1 284.12±30.861 135.45±32.104*200.13±15.376*Δ 220.14±26.648*Δ 255.20±26.648*Δ 260.82±29.312Δ

2.5 免疫组化法检测CTLA-4和B7-1表达水平

如表8、图2所示，3个疗程后，模型组CTLA-4 IOD比正常组显著降低（P＜0.05）；各药物治疗组CTLA-4 IOD值比模型组显著提高（P＜0.05），呈剂量-反应关系。这说明药物治疗帮助CTLA-4表达增强，抑制炎性反应，且同药物剂量有关。

图2 各组大鼠踝关节CTLA-4的免疫组化图片（×200）

表8 各组大鼠踝关节CTLA-4表达水平（±s，n=8）

表8 各组大鼠踝关节CTLA-4表达水平（±s，n=8）

注：与正常组比较，*P＜0.05；与模型组比较ΔP＜0.05。

分组正常组模型组森登-4低剂量组森登-4中剂量组森登-4高剂量组甲氨喋呤组CTLA-4 IOD 4258.95±315.078 2180.85±163.786*Δ 5089.93±575.053*Δ 6099.26±599.169*Δ 7315.98±794.078*Δ 7170.33±221.482*Δ

如表9，图3所示，模型组B7-1 IOD值比正常组显著升高（P＜0.05）；3疗程药物治疗后，各治疗组B7-1 IOD值比模型组显著降低（P＜0.05），同样呈剂量反应关系。

图3 各组大鼠踝关节CD80免疫组化图片（×200）

表9 各组大鼠踝关节B7-1的表达水平（±s，n=8）

表9 各组大鼠踝关节B7-1的表达水平（±s，n=8）

注：与正常组比较，*P＜0.05；与模型组比较ΔP＜0.05。

分组正常组模型组森登-4低剂量组森登-4中剂量组森登-4高剂量组甲氨喋呤组CD80 IOD 2500.95±511.428 8000.68±1567.362*5500.56±564.472*Δ 5000.37±452.291*Δ 4200.32±976.382*Δ 4000.00±774.647*Δ

3 讨论

RA是一类全身性自身免疫疾病，其病理特点主要为关节滑膜炎及慢性血管翳的形成，滑膜炎的慢性长期存在对关节软骨和骨有持续破坏，最终造成关节畸形、丧失正常功能。RA涉及的炎性因子主要有IL-6、TGF-β等，目前中药及蒙药尤其是森登-4在临床上治疗RA疗效确切且有着重大前景，其由森登（文冠木）、川楝子、诃子、栀子四类具有清热、止痛、消肿的药物组成，具有较好的抗炎镇痛作用，但具体的机制尚未完全明确。

CTLA-4是免疫平衡的关键负调节因子。近年来研究发现CTLA-4同CD28竞争性结合B7-1/B7-2（CD80/CD86），以启动抑制信号，限制T细胞增殖，使效应T细胞失活，免疫应答恢复平衡。但CTLA-4/B7-1的结合更稳定，且具有抑制淋巴细胞增殖的作用，而B7-2无此作用。RA患者的CTLA-4/CD28失衡是RA的一种致病机制[14]。CTLA-4能够有效抑制RA患者关节破骨细胞的分化，减少骨破坏[15]，抑制B细胞中B7-1/B7-2的表达，降低IL-6和TNF-α水平，起到免疫抑制作用。这表明CTLA-4可能通过抑制T、B细胞激活治疗RA。

本研究发现各治疗组大鼠炎细胞浸润、滑膜细胞增生的病理学评分和血清IL-6、sCTLA-4的水平较模型组均有下调，其中甲氨喋呤组和森登-4高剂量组下降程度最高；而各治疗组血清中抑炎因子TGF-β、sCD80（B7-1）的水平较模型组有不同程度的升高，最为明显的是森登-4高剂量组和甲氨喋呤组；提示森登-4治疗RA主要通过抑制炎症发挥作用，且疗效与剂量相关，这与森登-4成方中的药物多具有清热、止痛、消肿作用有关。徐晓艳等研究森登-4治疗RA从血管生成方面及炎症方面的结果同样提示了其重要的炎症抑制作用，同我们的研究结果一致，但本研究森登-4的剂量更为细化，可为将来药物研制提供重要理论数据。

本研究进一步的大鼠踝关节CTLA-4、B7-1免疫组化法结果显示，各剂量森登-4和甲氨喋呤组CTLA-4的表达有不同程度的上调，而各治疗组踝关节B7-1的表达则下调，说明蒙药森登-4通过CTLA-4/B7-1的负性信号通路实现对CIA大鼠关节炎反应有明显抑制作用。高剂量森登-4与甲氨喋呤治疗效果相似，但介于甲氨喋呤有着重要的致肝肺纤维化的副作用，且药物极量有限，且其他治疗RA的药物较为昂贵，加重患者的经济负担。森登-4是一类安全经济的治疗药物。

综上，蒙药森登-4在RA中有着重要的治疗价值和研究前景，但本研究尚为基础动物实验，需进一步的人体及相关组织学研究乃至更重要的临床研究去确证。且蒙药目前尚有一些不足之处，今后需要对森登-4的有效成分进行进一步提炼甚至研究成为更为方便应用的剂型，是今后的研究重点。本研究为森登-4治疗RA提供了新的思路和方向。