GGT在小鼠皮肤成纤维细胞中的表达及抑制酶活性对COL-I表达的影响

姜瑛 王祥 张蕾 常怀广

【摘要】目的：观察γ-谷酰基转移酶（gamma-glutamyl transferase， GGT）在小鼠皮肤成纤维细胞中的表达，探究抑制其活性后对细胞存活率及Ⅰ型胶原表达的影响。方法：胰酶、胶原酶两步消化法分离新生C57BL/6小鼠皮肤成纤维细胞并在培养板中培养至稳定贴壁生长；免疫组化方法检测GGT在小鼠皮肤成纤维细胞中的表达；生长噻唑蓝（MTT）法检测不同浓度GGsTOP对体外培养小鼠皮肤成纤维细胞存活率的影响；免疫荧光观察COL-I的表达。结果：GGT在小鼠皮肤成纤维细胞中广泛表达。抑制剂GGsTOP可以促进小鼠皮肤成纤维细胞增殖，并且使细胞内Ⅰ型-胶原（type I collagen， COL-I）蛋白水平的表达增强。结论：GGT 在小鼠皮肤成纤维细胞中广泛表达，抑制GGT酶活性后促进Ⅰ型-胶原表达，提示抑制剂GGsTOP可能促进创面愈合再上皮化过程。

【关键词】γ-谷酰基转移酶；皮肤成纤维细胞；细胞增殖；Ⅰ型-胶原；再上皮化

[中图分类号]R363 [文献标识码]A [文章编号]2096-5249（2021）05-0014-04

GGT is expressed in mouse skin fibroblast and GGT inhibitory activities is involved in the upregulation of CollagenⅠ expression in the mouse skin fibroblast

Jiang Ying1， 2， Wang Xiang1， Zhang Lei2， Chang Huai-guang2*（1. HaiShu Dentistry Department of Stomatological， NingBoZheJiang 315000， China； 2. NingBo Vocational College of Health， Department of Stomatology， NingBo ZheJiang 315000， China）

[Abstract] Objective： To observe the gamma glutamyl transferase （GGT） expression on mouse skin fibroblasts（MSF）， and explore whether inhibitory activity of GGT influence cell survival and collagen typeⅠ（COL-1） expression. Methods： Primary mouse dermal fibroblast cells were isolated from neonatal C57BL/6 mice by trypsin-collagen two-step digestion. The expression of GGT was analyzed by immunohistochemistry， and the effects of GGsTOP on proliferation of mouse skin fibroblasts cells were evaluated by MTT assay. The collagen type Ⅰ expression wasmeasured by immunofluorescence. Results： GGT was widely expressed on mouse skin fibroblasts. Inhibitors GGsTOP promoted mouse skin fibroblasts proliferation， and immunofluorescence showed that the protein expressions of COL-1were up-regulated. Conclusion： GGT was widely expressed in mouse skin fibroblast cells， inhibitors GGsTOP was related to the up-regulation of the expression of COL-1 while inhibition activity of GGT， inhibitors GGsTOP may promote on the re-epithelialization process of wound healing.

[Key words] gamma glutamyl transferase； skin fibroblast； cell proliferation； collagen type I； re-epithelialization

γ-谷氨酰轉肽酶（γ-glutamyltransferase， GGT）是γ-谷氨酰基循环的关键酶，表达在细胞表面，参与内源性调节因子白三烯及前列腺素的代谢。临床上，通常把血清中GGT水平升高作为肝脏疾病，酒精中毒，中风和糖尿病的指标[1-5]，并且在许多癌症中，包括肺癌，肝癌，前列腺癌，乳腺癌中可发现细胞内的GGT活性升高；生理学上，GGT活性维持细胞内谷胱甘肽氧化还原的平衡，调节细胞氧化应激水平[6]，这些过程均与皮肤组织愈合再上皮化的发生、发展及预后密切相关[7]。为此，本研究的目的是观察GGT在小鼠皮肤成纤维细胞中的表达情况，及抑制GGT酶活性后对小鼠皮肤成纤维细胞存活以及细胞外基质Ⅰ型-胶原的表达情况。

1 材料和方法

1.1动物C57BL/6 小鼠4只，鼠龄约为4周，由宁波卫生职业技术学院动物实验中心提供。

1.2 药品与试剂 GGsTOP （日本Wako）；N-乙酰基半胱氨酸 （NAC）（美国Sigma）；抗GGT单克隆抗体（ab55138，英国abcom）；抗Ⅰ型胶原多克隆抗体（ab34710，英国abcom）；DMEM培养液（美国Gibco公司）；胎牛血清（美国Gibco公司）；0.25%胰酶-EDTA（美国hyclone）；二甲基亚砜（dimathylsulfoxide，DMSO，美国Sigma）；噻唑蓝（MTT）（美国Sigma）；姬姆萨染液（碧云天生物技术有限公司）；抗荧光淬灭封片液（碧云天生物技术研究所）；GGsTOP溶液配制：将10mg GGsTop溶于10mL去离子水配制成10mM储存液，-80℃保存。实验前用DMEM培养液将其稀释成不同浓度条件培养液。

1.3仪器 超净工作台（上海力申科学仪器公司，中国，型号：HFsafe-1200TE）；二氧化碳培养箱（Thermo Fisher，美国，型号：371）；倒置显微镜（Leica，德国，型号：DMIL-LED）；荧光显微镜（Nikon，日本）全波长酶标仪（BioTek，美国，型号：Epoch）；离心机（Eppendorf，德国，型号：5702 R）；微孔板振荡器（Thermo Fisher，美国，型号：4625-1CEM）；电子天平（METTLER TOLEDO，中国，型号：EL204）。

1.4方法 ①小鼠原代皮肤成纤维细胞的分离培养及处理：来自新出生1～3 d的小鼠皮肤在含有0. 25%胰蛋白酶的离心管中4℃消化过夜。次日分离真皮并用0. 5 mg/ mLⅠ型胶原酶于37℃消化45 min，细胞混悬液过筛后用含10%FBS的DMEM 重悬后种培养皿，差速贴壁法去除非成纤维细胞。②姬姆萨染色染色法鉴定成纤维细胞形态学：爬片细胞经4%多聚甲醛固定，姬姆萨染液染色40 min后加入等量PBS混染5min，双蒸水冲洗、干燥后光镜下观察。③GGT在细胞中的小鼠皮肤成纤维细胞表达：取第四代小鼠皮肤成纤维细胞接种于24×24规格无菌处理的载玻片上，接种密度3×104/片。待细胞贴壁后弃掉原培养液，加入4%多聚甲醛固定，按照两步法免疫组化检测试剂盒使用说明书进行GGT抗体染色，光镜下观察。④MTT法检测牙周膜细胞的增殖：PDLC以2×103/孔接种于96孔板，待细胞贴壁后，无血清 DMEM液同步过夜。不同浓度抑制剂GGsTOP（5、10、20和50 μM）條件培养液培养，每浓度设8复孔，并设置调零孔。 1、3、5、7d后，每孔加MTT溶液20μL，继续培养4 h；弃孔内培养上清，每孔加入150 μL DMSO，振荡10 min，结晶物充分溶解；选择 490 nm波长，在酶标仪上测定各孔光吸收值。⑤免疫荧光检测COL-Ⅰ蛋白表达：实验分组：实验对照组、GGsTOP组、GGsTOP+NAC组、IgG阴性对照组。皮肤成纤维细胞胰酶消化，密度1×105/mL接种于处理好的24×24规格盖玻片上培养24h后，PBS漂洗3次，5min/次。按照实验分组加入不同试剂，放入37℃、5%CO2细胞培养箱中培养3d。4%多聚甲醛室温固定细胞30min，PBS漂洗3次，5 min/次。0.2% TritonX-100作用15min，PBS漂洗3次，5 min/次。滴加非免疫山羊血清封闭液，室温下孵育1h，倾去多余液体，不洗。滴加1%BSA稀释的一抗，同时以同型对照（兔多抗IgG）作为阴性对照，4°C下孵育过夜。次日PBS漂洗3次，5，滴加1%BSA稀释的FITC标记羊抗鼠荧光二抗或FITC标记羊抗兔二抗（1： 200），室温孵育1h。PBS漂洗3次，5 min/次，DAPI复染细胞核，室温孵育10min。PBS漂洗3次，5 min/次，荧光显微镜下图像采集。

1.5统计分析 采用SPSS 13.0数据统计包对实验资料进行方差分析，P<0.05表示差异有统计学意义，P<0.01表示差异有统计学显著意义。

2 结果

2.1小鼠皮肤成纤维细胞原代培养及鉴定 经过40min消化后，镜下观察部分细胞从组织游离。培养后1～2d，镜下观察部分游离出的细胞失去活力，漂浮培养液中；并可见活细胞已贴壁，形态为梭形、圆形或多角形。圆形和多角形为上皮细胞样形态，梭形为典型的成纤维细胞形态。早期上皮细胞生长占有优势，培养4d后（如图1 a），成纤维细胞生长占优势。培养7d左右，成纤维细胞基本铺满瓶底，汇合成单层，并混有少量铺路石样、扁平状多角形的上皮细胞（如图1 b）。传代后成纤维细胞长梭形，漩涡样生长（如图1 c）。

2.2 GGT在小鼠皮肤成纤维细胞中的表达组织学结果

在Nikon ECLIPSE 80i显微镜下观察，使用Nikon DS-Ri采集系统、NIS-Elements BR3.0图文处理系统摄片。免疫细胞化学染色显示小鼠皮肤成纤维细胞膜有棕黄色颗粒，进一步证实GGT作为膜蛋白，在小鼠皮肤成纤维细胞呈阳性表达（如图2）。

2.3 GGsTOP对小鼠成纤维细胞增殖的影响 与对照组相比，光镜显微镜下不同浓度GGsTOP没有对小鼠皮肤成纤维细胞的细胞形态产生影响，细胞长梭形，没有出现坏死的细胞，并呈漩涡样生长（如图3A）。 MTT结果显示浓度为5、10、20和50 μM GGsTOP处理1、3、5d后没有对细胞存活率产生影响，而10 μM GGsTOP在7d时较对照组增殖活性增强，差异具有统计学意义（P<0.05）（如图4B）。以上结果说明5～50 μM GGsTOP对小鼠皮肤成纤维细胞是安全浓度，并且10 μM GGsTOP可以促进小鼠皮肤成纤维细胞增殖。

2.4 GGsTOP促进小鼠皮肤成纤维细胞COL-I合成免疫荧光 结果显示，COL-I定位于细胞质中，在细胞核中不表达。10和20 μM GGsTOP组细胞中COL-I有明显的阳性信号表达，且信号明显强于对照组；Ig G组（Negative） COL-I信号表达为阴性（如图5）。

3 讨论

γ-谷氨酰基转肽酶是维持细胞内和细胞外谷胱甘肽平衡的关键酶，并且作为判断肝损伤程度常用的临床指标。GGT在不同的组织和器官表达和功能具有差异性。据研究，GGT在肾近曲小管、肝胆小管和脑毛细血管中免疫组织化学强阳性表达[8]。本研究关注皮肤成纤维细胞中GGT的阳性表达，并且发现抑制酶活性加入抑制剂GGsTOP后细胞表现为长梭形，并且没有出现坏死的细胞，表现出健康的成纤维细胞形态[9]。先前有研究表明GGT的传统抑制剂acivicin可以使癌细胞生长停滞[10]。并且也有研究证明acivicin可以延长果蝇生命周期，具有抗衰老的功能[11]。因此，我们分析可能是不同的细胞类型、分化的不同阶段及培养条件共同决定了GGsTOP促进增殖的作用。

研究表明GGT活性的改变可以使细胞内出现短暂的氧自由基ROS的改变，Zalata[12]观察精子内GGT的活性与ROS的产生呈反比例关系，也就是抑制GGT活性可以促进ROS产生。该观点也与Johnsen等人研究一致[13]。目前有许多研究证实ROS作为一种信号分子，直接参与了细胞运动的调控。创口附近的表层细胞层内形成的ROS对于损伤机制十分敏感，可以直接激活MAPK信号通路，并且ROS可以通过BMP/SMAD信号通路促进成纤维细胞的迁移[14]。

COL-Ⅰ是细胞外基质的重要成分[15]，其正常合成可以促进细胞增殖，对创面的愈合起到至关重要的作用[16]。细胞外基质对细胞的增殖、分化和迁移产生重要影响，也参与了创面愈合的过程[17]。在创面修复早期，成纤维细胞被激活、合成并参与分泌胶原，胶原蛋白在瘢痕形成和创面愈合中均起到一定作用。有实验证实[18]，小鼠创面难愈合与结缔组织含量降低有关，而结缔组织含量又与成纤维细胞和胶原蛋白的减少密切相关，这提示了胶原蛋白在细胞增殖和创面愈合中的作用。创面的愈合与瘢痕形成有关，瘢痕形成一般认为细胞外基质（extracellular matrix， ECM）过度沉积和降解减少的结果[19]。基于以上原因，我们决定分析GGsTOP作用下小鼠成纤维细胞COL-Ⅰ蛋白水平的变化。通过结果分析，在不同浓度的GGsTOP均可以在转录后水平促进COL-Ⅰ蛋白表達，加入抗氧化剂NAC抑制COL-Ⅰ的合成。该结果说明GGsTOP可以通过上升小鼠成纤维细胞中COL-Ⅰ水平促使不成熟的皮肤成纤维细胞向成熟的具有功能的皮肤成纤维细胞分化。然而GGsTOP通过何种具体机制发挥功能仍需进一步研究。

总之，我们首次证实了GGT在小鼠皮肤成纤维细胞中表达。GGT的新型抑制剂GGsTOP没有抑制小鼠成纤维细胞生长，并且与COL-Ⅰ的表达相关；并且也同样证实了GGsTOP促进牙周膜细胞COL-Ⅰ的表达可能与内源性ROS的改变有关，加入抗氧化剂NAC抑制COL-Ⅰ的合成。因此，以上结果为GGsTOP作为一种辅助皮肤组织愈合的药物提供了可能。

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基金项目：宁波市自然科学基金资助项目 （编号：202003N4187）

作者简介：姜瑛（1986.11-），女，满族，辽宁，博士，主治医师；研究方向：口腔医学。

*通信作者：常怀广，博士，副主任医师；研究方向：口腔医学。